「流式檢測細胞周期要點」.doc

流式檢測細胞周期要點： 最關鍵的就是減少細胞碎片和單細胞懸液的制備！1、細胞消化要理想，資料顯示最好消化時加EDTA，可使流式做的很漂亮；2、細胞消化后不可吹打過度，減少細胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的細胞容易破碎；3、 細胞用PBS洗滌離心，轉(zhuǎn)速不超過1000r/min，有文獻用800r/min；可考慮在此過程中用300目的尼龍網(wǎng)過濾一遍細胞（有人主張用鋼網(wǎng)，以 減少細胞與尼龍網(wǎng)粘連的損失，本人認為鋼網(wǎng)易損傷細胞，DNA外溢也會造成細胞粘連，所以在細胞數(shù)足夠的情況下，首選尼龍網(wǎng)）；4、離心后的固定，標準做法是將細胞懸液加入預冷70酒精，而不是向細胞中加酒精，這樣是為了減少細胞聚集，這一點很重要，很多人都忽視了！5、一般選擇4固定過夜；6、加染液前的洗滌仍要注意離心轉(zhuǎn)速的問題；7、 關于PI染液的組成及配方，應主要以文獻為主，PI（作用為DNA染色劑）的濃度從0.5g/ml,20g/ml，到50g/ml都見報道，響應的 求助顯示都可出良好結(jié)果，RNAs酶（由于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般濃度為50g/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主 要是通透細胞膜使PI能進入細胞核。8、檢測時細胞要達到12106個細胞（實際檢測是1萬到2萬個細胞），為了既保持初始條件相同，又可搜集到足夠的細胞，應選用多孔培養(yǎng)板，在搜集細胞時，濃度大、抑制強的組可多搜集些孔，以保證檢測的細胞數(shù)量。如果細胞數(shù)量太低，技師為了減少對流式細胞儀 的損傷，就會選擇高速流（一般的檢測用低速流，誤差?。瑱z測的質(zhì)量就會大大下降，數(shù)據(jù)的說服力就下降了！1. 收集細胞；2.30005000rpm離心5min，收集沉淀，重懸于200ul的PBS中，再次離心收集沉淀；3.75冰凍乙醇（-20度保存）4度固定過夜or-20度固定1h；4.離心收集沉淀，PBS洗一次（視沉淀量可忽略）；5.沉淀重懸于200500ul的PBS，加入Rnase A 37度水浴1h；6.400目紗布過濾至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上機器。1、Q：要做胃粘膜組織的DNA含量及倍體檢查，但取材后要等幾個星期才會做流式細胞術檢查，請問：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存，還是用乙醇固定？或者固定后再低溫下保存？A：我做過乳腺細胞的DNA含量測定，取得組織以后，先處理成單細胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的最終濃度為50%，這樣固定的細胞懸液可以至少保存12小時，最多可保存一個月，上機檢測前再加PI綜合染液。我就是這樣做的，保存了將近三個星期，結(jié)果還可以，變異系數(shù)為5%.2、實驗中想用PI分析細胞周期及凋亡率，請教幾個問題：Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配嗎？A：RNaseA用PBS配制沒有問題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。Q：（2）測細胞周期和凋亡率時都要用RNAs酶，可以一起檢測嗎？A：用流式細胞儀測定時細胞周期和凋亡率是同時測定的，不用擔心。Q：（3）Tritonx100是固定劑吧，用了70的冷乙醇（是4嗎？），是不是就不用Tritonx100固定了？A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75的乙醇于-20度固定。Q：（4）還要設什么內(nèi)參標準（5雞紅細胞）嗎？A：對照肯定是需要的，這個根據(jù)自己的需要進行設置。Q：（5）不用試劑盒行不行??？A：完全可以不用試劑盒。以下提供一個自己的實驗步驟供參考：（1）200g離心10min收集細胞；（2）棄去上清，PBS漂洗一次，將細胞重懸于預冷的80%乙醇中，-20C固定24h以上；（3）進行流式細胞儀檢測前，200g離心10min收集固定后的細胞；（4）PBS洗滌一次，200g離心10min收集細胞；（5）將細胞重懸于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室溫孵育30min；（6）將經(jīng)PI染色和RNase A消化后的細胞懸液用300目的尼龍膜過濾后即可利用流式細胞儀進行細胞周期分布和凋亡細胞定量的分析。3、Q：流式檢測細胞周期時加RNA酶所需的溫度？A：其實有關RNA酶在凋亡檢測制樣過程中使用的必要性問題尚有人持不同意見，該觀點的人認為RNA酶在環(huán)境中無所不在，常規(guī)制樣過程中所接觸的試劑和環(huán)境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡便實驗操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過經(jīng)典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。至于染色時使用4度，是因為低溫可減弱分子運動，增強熒光染料結(jié)合的穩(wěn)定性和減少可能的熒光損耗。上流式前細胞用75乙醇固定行嗎？4、Q：我養(yǎng)腫瘤細胞，測周期?？吹教诱f70乙醇必須用PBS和乙醇配，用水配細胞會碎裂，有帖子說PBS和乙醇配會出現(xiàn)絮狀物。上流式前細胞用75乙醇固定，就用買來的現(xiàn)成的瓶裝75乙醇，行嗎？必須那么嚴格嗎？A：先用冷PBS懸浮細胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細胞充分分散成單細胞。之后緩慢加入無水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會導致細胞團聚的現(xiàn)象，很難重懸成單細胞。乙醇固定之后沒有細胞沉淀。5、Q：我要做流式分析細胞周期，我大概收集了10的6次方細胞，但細胞在乙醇固定之后，還看到有細胞沉淀的，但PBS洗滌兩次之后，就基本沒什么細胞沉淀了，上機發(fā)現(xiàn)就發(fā)現(xiàn)不了細胞了。這是怎么回事?。吭趺唇鉀Q這個問題?。緼：很可能是洗細胞的過程中丟失了，解決辦法有：（1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機（2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。（3）離心的轉(zhuǎn)速或時間可稍微增加一點兒（4）每次加抗體時，吸頭最好不要接觸液面；混勻時最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細胞。6、Q：流式細胞PI單染中為什么用RNAse？A：在測細胞周期時，因為已經(jīng)在細胞膜打孔了，PI很容易透過細胞膜和DNA結(jié)合，但RNA也是核酸，也會被染色，為避免干擾染色前需用RNAse降解RNA。這樣PI只染DNA，能精確以熒光強度反映DNA的含量。7、最近做了幾次流式細胞儀檢測細胞周期，發(fā)現(xiàn)有幾個問題：Q：（1）我所用的是腫瘤細胞， 但是同樣的細胞類型，同樣的處理因素，雖然兩次獨立實驗作出來的結(jié)果總體趨勢都是在某種藥物干預后，S期比例下降，但兩次結(jié)果S期比列具體數(shù)值相差很大，同樣，G2/M期在干預前后無變化，但兩次獨立實驗數(shù)值卻相差很大，那么可以說，做流式是每次細胞狀態(tài)不一樣，結(jié)果也會相差很大，是不是細胞密度會對結(jié)果產(chǎn)生很大影響，那么如果細胞密度在60-70%時和細胞已經(jīng)長滿（90%以上）也會導致各期數(shù)值的差異？如果是這樣，長滿的細胞（不再增殖）是表現(xiàn)的G1或S或G2/M上升還是下降？A：應該是兩批細胞在實驗時本身所出周期不同所致，可以在實驗前進行細胞的同步化處理，減少批間差異。實驗細胞應處于對數(shù)生長期，而不能是完全長滿，一般在5080比較好。自然狀態(tài)下，不增殖的細胞應該處于G0/G1期。Q：（2）其次就是結(jié)果分析，細胞周期特異性藥物如抗代謝藥作用后主要表現(xiàn)的是S期比例下降，細胞被阻滯在G1期，自然G1期比列升高。而有些植物藥如長春堿類或紫杉醇類，主要作用于M期，那么結(jié)果是否表現(xiàn)為G2期比例升高，還是S期也相應升高？還有就是細胞經(jīng)抗腫瘤藥物作用后反而出現(xiàn)的S期升高，可能是那些原因，如何分析？A：周期特異性藥物阻滯哪一期，哪一期就升高，不會使其它階段細胞增多。8、Q：我用流式做胃癌細胞周期分析時不出現(xiàn)S、G2/M峰？什么原因呢？自己分析可能為PI沒染上色，是不是染色時間太短呢？A：你用了多少PI染色多久呢？一般來說30分鐘夠了.我覺得可能是打孔或者rna沒有處理掉沒有成功，染色時間并不是關鍵。9、Q：做流式細胞時，PI 染色，PI的濃度應該是多少?還有就是400目的篩網(wǎng)是什么？不用可以嗎？謝謝。A：100ug/ml，一般用400目的篩網(wǎng)是用來將粘在一起的細胞團濾掉的，否則會出現(xiàn)人為的多倍體干擾，分析的時候需要的是單個的細胞，不過如果經(jīng)驗豐富也可以gate掉的。如果你沒有條件，建議在染色之前將細胞彈的很散，再進行染色10、Q：流式細胞儀觀察細胞周期樣品怎樣準備？A：給你介紹一下我的實驗方法，我做的是周期檢測，要做平行樣，六孔板做的。（1）收集先棄液，將你要實驗（你已經(jīng)處理好的）的細胞PBS洗兩次，加胰酶消化（注意：如果要是加藥物或者其他處理過的細胞，棄液和PBS洗液均收集）；（2）加培養(yǎng)基終止消化，打勻在分別收到各自離心管中（注意，收集過程中及后續(xù)過程中槍頭不要混用，要不平行樣也就沒意思了）；（3）離心，1000rpm，5min棄液；（4）4度PBS（1到2ml）洗兩次，離心，1000rpm，5min棄液；（5）加入負20度70%酒精（1到2ml）打勻，固定，至少半個小時以上，（不做的話，可放入4度冰箱保存2-3周問題不大）；（6）離心，1000rpm，5min棄酒精；（7）4度PBS（1到2ml）洗，離心1000rpm，5min棄液；（8）4度PBS（1到2ml）洗，打勻后，將細胞懸液用100 目的紗布直接過濾到流式