細(xì)菌鑒定方法.doc

1.2.1 形態(tài)學(xué)特征 按照東秀珠和蔡妙英編常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)（1999），中科院微生物所編著一般細(xì)菌常用鑒定方法（1978）的方法進(jìn)行鑒定。芽孢桿菌屬鑒定到種，參照了蔡妙英等譯芽孢桿菌屬（1980）的方法。（1）革蘭氏染色：挑選少許菌苔，涂布于干凈玻片的蒸餾水中，風(fēng)干固定，結(jié)晶紫染色（結(jié)晶紫2g，草酸銨0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化鉀2g，水300 ml）作用1min，水洗，脫色，用番紅O液染3min，水洗，風(fēng)干，光學(xué)顯微鏡觀察。（2）鞭毛染色：將1624h菌齡的菌苔在載玻片上的水滴中輕蘸幾下，將玻片傾斜，使菌液緩慢流到另一端，然后平放在空氣中干燥。干燥后滴甲液（丹寧酸5g，F(xiàn)eCl3 1.5g，15%福爾馬林2ml，1%NaOH 1ml，蒸餾水100 ml）染610min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3 溶液）加熱復(fù)染30min，蒸餾水沖洗，干燥，鏡檢，菌體為深褐色，鞭毛為褐色。（3）運(yùn)動(dòng)性：半固體瓊脂穿刺法，將菌種接在可使鑒定菌生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)基中，其中含0.30.6%的瓊脂。適溫培養(yǎng)，運(yùn)動(dòng)性可用透射光目測(cè)，如生長(zhǎng)菌只生長(zhǎng)在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表明鑒定菌無(wú)運(yùn)動(dòng)性；如生長(zhǎng)菌由穿刺線向四周呈云霧狀擴(kuò)散，其邊緣呈云霧狀，則表示鑒定菌有運(yùn)動(dòng)性。（4）芽孢染色：孔雀綠染色法。按革蘭氏染色涂片后，用飽和的孔雀綠水溶液（約7.6%）染20 min，水沖洗后在用0.5%番紅O復(fù)染2030s，水洗，吸干，鏡檢。芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。（5）抗酸染色：常規(guī)涂片，石碳酸復(fù)紅（10%堿性復(fù)紅乙醇飽和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加熱染色5 min，傾去染液用酸性乙醇脫色，呂氏美藍(lán)（2%亞甲基藍(lán)乙醇飽和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）復(fù)染2min，水洗，吸干，鏡檢。（6）莢膜染色：在載片一端滴一滴無(wú)菌水，取少許菌苔在水滴中制成懸液。取一滴墨汁與菌懸液混合，并用另一載片之一端將此水滴在載片上刮成薄膜風(fēng)干。用純甲醇固定1min，加0.5%番紅O液數(shù)滴滴于涂片上，沖去殘余甲醇，并染30s，然后傾去染液，立即吸干，鏡檢。1.2.2 培養(yǎng)及生理特性（1）菌落形態(tài)：用劃線法將菌種接在平板培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)12d，出現(xiàn)單菌落開(kāi)始觀察，包括形狀和大小，邊緣，表面，隆起形狀，透明度，菌落和培養(yǎng)基的顏色等。（2）生長(zhǎng)溫度和耐熱性：將菌種轉(zhuǎn)接到幾支試管中，分別在不同溫度下培養(yǎng)，每處理2管，目測(cè)生長(zhǎng)情況。（3）芽孢菌厭氧性測(cè)定：將菌種用外徑為1.5mm的接種環(huán)穿刺接種在厭氧培養(yǎng)基（酪素水解物20g，NaCl 5g，巰基醋酸鈉2g，甲基次硫酸鈉1g，瓊脂15g，蒸餾水1000 ml），30培養(yǎng)，3d和7d分別觀察，表面生長(zhǎng)者為好氧菌，如沿穿刺線或下部生長(zhǎng)者為兼性厭氧菌或厭氧菌。（4）碳源利用：將菌種接種在各種碳源斜面培養(yǎng)基（MgSO47H2O 0.2 g ，（NH4）H2PO4 H2O 0.5 g ，K2HPO4 0.5g，CaCl22H2O 0.1g，（NH4）2SO4 2.0 g ，蒸餾水1000 ml，碳源分別為蔗糖、乳糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇等，終濃度為0.1%0.2%）上，適溫培養(yǎng)1d，以菌懸液接種，能生長(zhǎng)者即培養(yǎng)基變渾濁為陽(yáng)性，否則為陰性。（5）氮源利用：將菌種接種在各種氮源斜面培養(yǎng)基（MgSO47H2O 0.2 g ，（NH4）H2PO4 1 .36g ，Na2HPO4 2.13g，CaCl2 5.00 ml，F(xiàn)eSO47H2O 0.50 ml，葡萄糖10.0 g ，蒸餾水1000 ml），氮源分別為氨態(tài)氮如磷酸氫二銨或硝態(tài)氮如硝酸鉀、乳糖、果糖、木糖、半乳糖等，終濃度為0.2%0.5%）上，適溫培養(yǎng)1d，以菌懸液接種，能生長(zhǎng)者即培養(yǎng)基變渾濁為陽(yáng)性，否則為陰性。（6）檸檬酸鹽利用：將菌種接種在檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基（NaCl 5g，MgSO47H2O 0.2 g ，（NH4）H2PO4 1 g ，K2HPO43H2O 1g，檸檬酸鈉2g，0.04%酚紅10ml，瓊脂12g，蒸餾水1000 ml）上，適溫培養(yǎng)37d，培養(yǎng)基變?yōu)樘壹t色者為陽(yáng)性，否則為陰性。（7）耐鹽性和需鹽性：將菌種分別接種在含3%，5%，7%，10% 含NaCl的肉汁胨液體培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)3d、7d，目測(cè)生長(zhǎng)情況。（8）丙酸鹽利用：將菌種接種在丙酸鹽斜面培養(yǎng)基上（丙酸鈉2g，NaCl 5g，MgSO47H2O 0.2 g ，（NH4）HPO4 1 g ，K2HPO43H2O 1g，0.04%酚紅 10ml，瓊脂12g，蒸餾水1000 ml）上，適溫培養(yǎng)37d，培養(yǎng)基變?yōu)樘壹t色者為陽(yáng)性，否則為陰性。1.2.3 生化特性測(cè)定（1）氧化酶：將1%的四甲基對(duì)苯二胺水溶液滴于干凈培養(yǎng)皿的濾紙上，濾紙濕潤(rùn)即可，用牙簽取1824h的菌苔涂抹于濕潤(rùn)濾紙上，在10s內(nèi)涂抹的菌苔呈藍(lán)色為陽(yáng)性，60s以上呈藍(lán)色者不計(jì)，按陰性處理。（2）接觸酶：將24h培養(yǎng)的斜面菌種，用牙簽取菌苔涂抹于已滴有3%過(guò)氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，無(wú)氣泡產(chǎn)生為陰性。（3）葡萄糖氧化發(fā)酵：將24h幼齡菌種穿刺接種于休和利夫森試管培養(yǎng)基（蛋白胨2g，NaCl 5g，葡萄糖10g，瓊脂6g，溴百里酚藍(lán)少許，蒸餾水1000ml），每株4支，其中2支上面覆蓋凡士林石蠟油，適溫培養(yǎng)1d、3d、7d、14d觀察，只有開(kāi)管變黃者為氧化型，開(kāi)管和閉管均變黃者為發(fā)酵型。（4）甲基紅（MR）：培養(yǎng)48h的菌種試管培養(yǎng)液（蛋白胨5g ，葡萄糖5g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.07.2）中加入一滴甲基紅試劑，紅色為甲基紅陽(yáng)性反應(yīng)，黃色為陰性反應(yīng)。（5）V-P測(cè)定：將培養(yǎng)24h的菌種培養(yǎng)液（培養(yǎng)基成分同甲基紅）與40%NaOH 等量相混，加入少許肌酸，10min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，有時(shí)需要放置更長(zhǎng)時(shí)間才能出現(xiàn)紅色。（6）淀粉水解：將菌種接在淀粉瓊脂培養(yǎng)基（在肉汁胨中加入0.2%的可溶性淀粉）上，培養(yǎng)25d，形成明顯菌落后，將碘液滴在平板上，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈。菌落周圍如有不變色的透明圈，表示淀粉水解陽(yáng)性；仍藍(lán)色為陰性。（7）脲酶：將培養(yǎng)3d的斜面菌苔做成菌懸液，加入一滴酚紅指示劑，調(diào)pH至7，使液體呈紅色，分成2份，其中1份加入0.1g尿素，幾分鐘后指示劑變紅者為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮?。?）苯丙氨酸脫氨酶：將菌種接在苯丙氨酸斜面培養(yǎng)基（酵母膏3g，NaCl 5g， Na2HPO4 1g，瓊脂12g，L-苯丙氨酸1g，蒸餾水1000ml）上，37培養(yǎng)824h測(cè)定，將10%的FeCl3 溶液滴在生長(zhǎng)菌的斜面上，變綠為陽(yáng)性反應(yīng)，不變?yōu)殛幮苑磻?yīng)。 （9）明膠液化：將菌株接種在明膠液化培養(yǎng)基（蛋白胨5g，明膠150g，水1000ml，pH 7.07.2）上，2528培養(yǎng)，于5、10、20、30d觀察液化程度。 （10）牛奶分解：將新鮮菌種接于石蕊牛奶（2.5%石蕊水溶液，脫脂牛奶100 ml）中，2528培養(yǎng)，于3、5、10、20、30d觀察，還原-石蕊褪色變白；胨化-牛奶變清；產(chǎn)酸-石蕊變紅；產(chǎn)堿-石蕊變藍(lán)；酸凝和酶凝-牛奶結(jié)塊、凝固。（11