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逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR(nested RT-PCR)一、實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)RT-PCR反應(yīng)的基本原理。掌握血液等液體標(biāo)本中提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄的技術(shù)。了解其他標(biāo)本(如組織塊)中提取RNA的技術(shù)。二、實驗原理RT-PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用以RNA為模板合成cDNA,再以cDNA為模板擴增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,可用于檢測細胞中基因表達水平,細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。巢式PCR是一種特殊的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),使用兩對(而非一對)PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物(外引物)擴增片段與普通PCR相似;第二對引物(內(nèi)引物)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部,使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片段,則第二次繼續(xù)在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此,巢式PCR特異性非常高。三、主要儀器PCR擴增儀、高速冷凍離心機/臺式高速離心機、Vortex震蕩混勻器、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電熱恒溫水浴鍋四、主要試劑TRIzol ReagentTM、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶(MgCl2)、dNTP Mixture,10 mmol/L、瓊脂糖、溴化乙錠*、DNA Marker、三氯甲烷(氯仿)、異丙醇DEPC*(焦碳酸乙二酯)處理水:加100l DEPC于100ml超純水中,使DEPC的體積分?jǐn)?shù)為0.1%,室溫震蕩至少4h;然后高壓蒸汽滅菌20min。溶解RNA所需的DEPC水用無RNase的1.5ml 微量離心管分裝,-20保存;用于配置75%乙醇的DEPC水則直接置于4保存。75%乙醇溶液:取75ml無水乙醇用DEPC處理水定容至100ml,4保存。所用容器及量筒均需洗凈后200干烘8h。5TBE:Tris堿54g,硼酸27.5g,0.5mol/L EDTA(pH8.0)20ml,加蒸餾水定容至1L,室溫保存。0.5TBE緩沖液:用蒸餾水將50TBE緩沖液稀釋10倍,于室溫下保存。五、操作步驟病毒RNA的提?。?. 將待測標(biāo)本、陰陽性對照取出解凍;再取出2套RNase-free(無RNase)的1.5ml微量離心管和2支RNase-free的0.5ml微量離心管,并進行標(biāo)記;2. 取一套標(biāo)記好的離心管,每管加入TRIzol 500l,再加入100l血清/細胞培養(yǎng)液等液體標(biāo)本和對照(陰性對照最先加,標(biāo)本居中,陽性對照最后加;注意將槍尖伸至TRIzol中),用Vortex震蕩混勻5sec(液體無明顯分層),室溫靜置5min;3. 每管加入氯仿100l(注意沿著管壁加液,避免液體飛濺),用Vortex震蕩混勻15sec(液體無明顯分層),室溫靜置3min;4. 4、12000rpm離心15min;待離心結(jié)束后,小心吸取上層水相至另一套標(biāo)記好的RNase-free的1.5ml 微量離心管,加入等體積異丙醇(根據(jù)吸取的量估算,可適當(dāng)多加一些;注意沿著管壁加液,避免液體飛濺),顛倒混勻,室溫靜置15-30min;同時,確認(rèn)恒溫水浴鍋已打開;5. 4、12000rpm離心10min;待離心結(jié)束后,直接倒去上清,每管加入75%乙醇500l重懸沉淀(注意沿著管壁加液,避免液體飛濺),輕柔顛倒混勻5次;與此同時,取出特異性引物/寡核苷酸引物/隨機引物、RNasin、5RT Buffer、dNTP Mixture解凍;6. 4、8000rpm離心5min;待離心結(jié)束后,小心倒去上清;用瞬時離心機簡短離心1-2s,仔細觀察沉淀位置,沿管壁吸出底部殘余液體;室溫晾干5-10min(應(yīng)防止過分干燥);7. 最后加入20l DEPC處理水溶解RNA沉淀,直接用于后續(xù)實驗,或保存于-80備用。逆轉(zhuǎn)錄(RT):在0.5ml RNase-free(無RNase)的微量離心管中依次加入:DEPC處理水9.0l外循環(huán)下游引物(20pmol/l)0.6lRNA酶抑制劑(40U/l)0.1l總體積9.7l再加入RNA溶液5l,70水浴5min,再冰浴5min;再依次加入:5AMV逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4.0ldNTP Mixture(10mol/L)1.0lRNA酶抑制劑(40U/l)0.1lAMV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/l)0.2l總體積5.3l42溫育40min。巢式PCR(nested PCR):第一輪PCR擴增體系為:10PCR反應(yīng)緩沖液2.0lMgCl2(25mol/L)1.2ldNTP Mixture(10mol/L)0.2l上游引物(20 pmol/l)0.2l下游引物(20 pmol/l)0.2lTaq DNA聚合酶(5U/l)0.2lcDNA2.0ldd H2O補足反應(yīng)體積至20l第二輪PCR擴增體系為:10PCR反應(yīng)緩沖液2.0lMgCl2(25mol/L)1.2ldNTP Mixture(10mol/L)0.2l上游引物(20 pmol/l)0.2l下游引物(20 pmol/l)0.2lTaq DNA聚合酶(5U/l)0.2l第一輪PCR產(chǎn)物2.0ldd H2O補足反應(yīng)體積至20lPCR儀擴增條件為:94 預(yù)變性 5min94 變性 30s53 復(fù)性 30s 35個循環(huán)72 延伸 40s 72 再延伸 5minPCR產(chǎn)物的檢測(瓊脂糖凝膠電泳):1. 瓊脂糖凝膠板的制備:稱取2.0g瓊脂糖,加入100ml 0.5TBE,于微波爐中加熱融化均勻,冷卻到60-70加EB至終濃度0.5g/ml,倒入封好的凝膠槽,厚度約3-5mm,在距底板0.5-1mm的位置放置樣品梳,待冷卻成形后取出梳子及隔板,放入水平電泳槽中,緩沖液沒過膠面1-2mm即可;2. 加樣:樣品中加入1/5體積的6凝膠上樣緩沖液,混勻,取5-6l加入凝膠點樣孔中,同時加入DNA Marker;3. 電泳:100V恒壓,電泳30min,使PCR產(chǎn)物向陽極移動。待溴酚藍移至凝膠的2/3距離時,關(guān)閉電源;4. 取出凝膠,置于紫外交聯(lián)透射儀上檢測擴增條帶并在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。首先,你要確認(rèn)切膠后是否回收到了RTPCR的產(chǎn)物(方法、操作不當(dāng)會導(dǎo)致回
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