HSC分離方法.doc

分離實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟： 1.饑餓處理在分離前饑餓16-24 h。2.麻醉戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔麻醉或者斷頸快速處死。3. 手術(shù)以“U”型切口打開腹腔。將腸管推向腹腔左側(cè)，暴露門靜脈及下腔靜脈，將充滿前灌流液的靜脈滯留針插入門靜脈。4. 灌流打開恒流泵的開關(guān)開始灌流，并迅速剪斷下腔靜脈。先以GBSS（不含Ca2+、Mg2+，pH7.4）肝門靜脈灌流沖掉血細(xì)胞，流速7mlX5min。待沖出液為無色時，換含0.16mg/mL collagenase IV和0.02mg/mL Dnase I以7ml/min速度灌流10min，將肝內(nèi)結(jié)締組織破壞。當(dāng)肝臟變白變軟后，摘下肝。5. 細(xì)胞懸液的制備剪子小心剪成大小約為2mm3的小塊，含0.16mg/mL collagenase IV和0.04mg/mL Dnase I的GBSS（含Ca2+、Mg2+，pH7.4）37度溫和震蕩消化20-30min，反應(yīng)以FBS終止。得到的單細(xì)胞懸液依次通過200目尼龍網(wǎng)和300目尼龍網(wǎng)，除去沒有消化完全的組織塊。6. 肝細(xì)胞的分離得到的濾液低速離心（50g，3min，2次），得肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。將肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞沉淀懸于密度為1.06g/mL的梯度液，4度50g離心10min，得到的沉淀為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。小心吸出上層液體，沉淀以PBS 50g 3min洗2次。7. 肝星狀細(xì)胞的分離上清400g 4度離心10min得到沉淀主要為非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。沉淀以含BSA和0.02mg/mL Dnase I的GBSS（不含Ca2+、Mg2+）洗一次。沉淀溶解于5mL 15%Optiprep，上層小心鋪10%Optiprep后1400g 4度離心17min。10%上方為HSC，15%和10%界面之間主要為內(nèi)皮細(xì)胞和枯否細(xì)胞。小心吸取出10%界面以上細(xì)胞，400g 4度離心10min。用GBSS（不含Ca2+、Mg2+，pH7.4）洗一次之后，得到HSC。 得到星形細(xì)胞分別通過密度為1.089g/mL的梯度進(jìn)行純化，1400g 10min，收集上層細(xì)胞，除去破碎細(xì)胞和各種雜質(zhì)。 試驗(yàn)流程暴露門靜脈，前灌流液灌流（37 ）7 ml/min 58 min0.16mg/mL collagenase IV和0.02mg/mL Dnase I（37 ） 7 ml/min 10min剪碎肝臟，加0.16mg/mL collagenase IV和0.04mg/mL Dnase I的GBSS 50ml，震蕩20-30min 兩層紗布過濾至兩個50ml離心管中 50g 3min離心 上清 400g 10min 得沉淀10% optiprep 密度梯度1400g 17min離心 取 DNA酶I和細(xì)胞懸液間界面細(xì)胞，1700 rpm 10min 沉淀加適當(dāng)PBS重懸實(shí)質(zhì)細(xì)胞純度鑒定肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)CD13，F(xiàn)ITC-CD13抗體4孵育30分鐘，PBS洗3次。直接上機(jī)，流式檢測。星形細(xì)胞純度鑒定星形細(xì)胞特異表達(dá)GFAP，GFAP抗體4孵育30分鐘，PBS