乳酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn).docx

米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸1 前言乳酸是一種天然有機(jī)化合物，它廣泛地應(yīng)用在食品、化工、醫(yī)藥品中，是一種重要的原料。乳酸可分為L(zhǎng)-乳酸和D-乳酸兩種類型，人體不能過多的攝入D-乳酸，過多的攝入會(huì)使新陳代謝發(fā)生紊亂。L-乳酸的聚合物是一種可降解的、具有良好韌性的新型材料，其原料為可再生資源。因此L-乳酸已近被認(rèn)為最具發(fā)展?jié)摿Φ牟牧?。目前已?jīng)在社會(huì)上各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。目前社會(huì)工業(yè)上最主要生產(chǎn)的是L-乳酸，而且大都采用米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸，這種方法具有操作簡(jiǎn)單、原料便宜、產(chǎn)物純度高、菌種易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但由于技術(shù)不夠高使其也有缺點(diǎn)，如生產(chǎn)的周期長(zhǎng)、糖的轉(zhuǎn)化效率太低、菌種易于結(jié)成團(tuán)。抑制了工業(yè)上的應(yīng)用，因此必須解決上述問題，才能使米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸在工業(yè)上得到廣泛的應(yīng)用。2 目的本實(shí)驗(yàn)的目的主要是認(rèn)識(shí)米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的過程，掌握米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法，使學(xué)生對(duì)米根霉發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸有感性的認(rèn)識(shí)，并掌握葡萄糖及乳酸的化學(xué)測(cè)定方法。3 原理葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，在細(xì)胞液中通過EMP途徑被分解為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下直接脫氫形成目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-乳酸，其反應(yīng)式如下：2C6H12O63C3H6O3 + C2H5OH + CO24 實(shí)驗(yàn)材料4.1 菌種 本實(shí)驗(yàn)所使用的菌種為米根霉(Rhizopus oryzae)。4.2 使用的主要試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱 規(guī)格 葡萄糖分析純木糖 分析純瓊脂粉 生化試劑硫酸銨分析純3,5一二硝基水楊酸分析純七水合硫酸鋅分析純碳酸鈣分析純鈣羧酸分析純磷酸二氫鉀分析純結(jié)晶酚分析純氯化鈉分析純氫氧化鈉分析純乙二胺四乙酸二鈉分析純無水亞硫酸鈉分析純鹽酸分析純酒石酸鉀鈉分析純實(shí)驗(yàn)儀器名稱SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)SHP-160D型智能低溫生化培養(yǎng)箱HYG-B全溫度搖瓶柜TU-1810紫外可見分光光度計(jì)LDZX-50KBS立體壓力蒸汽滅菌器JZC-TSC電子計(jì)重天平CP114型電子天平DHG-9101-OS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱HH-S恒溫水浴鍋BCD-209KHA型冰箱3L發(fā)酵罐5 培養(yǎng)基5.1 菌種斜面保藏培養(yǎng)基 取新鮮的馬鈴薯，去皮以后稱取200 g切成小塊，加入1000 mL水，煮沸20 min以后(能用玻璃棒戳破即可)，用紗布過濾，在濾液中加入20 g瓊脂粉和20 g葡萄糖，然后加熱融化并補(bǔ)足失水至1000 mL。放置于高壓蒸汽滅菌鍋中121下滅菌15 min后，將其倒入三角瓶中冷卻制成斜面培養(yǎng)基。 5.2 種子與發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)(1) 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO4 4 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、ZnSO47H2O 0.44 g/L、MgSO47H2O 0.25 g/L，CaCO3 40 g/L，pH值自然，以上培養(yǎng)基皆于121滅菌15 min。種子培養(yǎng)基葡萄糖為40 g/L。6 檢測(cè)方法 6.1 EDTA法測(cè)定發(fā)酵液中乳酸的含量 （1） 溶液的配制 (1) 0.05 mol/L EDTA溶液：準(zhǔn)確稱取18.612 g的EDTA，加水溶解以后定容至 1000 ml。 (2) 鈣指示劑：稱取1 g鈣羧酸和100 g的氯化鈉，使兩者充分混合后，保存在棕色瓶中備用。 （2） 實(shí)驗(yàn)方法 取l mL發(fā)酵液(V1)加入到盛有100 mL蒸餾水的三角瓶中，然后加入10 ml1 mol/L的NaOH溶液與少量鈣指示劑，用0.05 mol/L EDTA溶液滴定。溶液由紫紅色變?yōu)榧兯{(lán)色即為滴定終點(diǎn)，消耗EDTA溶液的體積記為V2。 （3） 結(jié)果計(jì)算 L-乳酸的含量(g/L)=(90.080.1V1)/V2 V1:滴定到終點(diǎn)時(shí)消耗的EDTA溶液體積(ml) V2:X吸取的發(fā)酵液體積(通常為1 ml) 6.2 DNS法發(fā)測(cè)定酵液中殘?zhí)呛?由于單糖含有游離的酮基或醛基，具有還原性，因此單糖屬于還原糖。而蔗糖和多糖等，由于不含游離的醛基或酮基，因而他們屬于非還原性糖。多糖能夠被水解為單糖，此時(shí)可以通過測(cè)定水解后單糖的含量來測(cè)定原來總糖的含量。發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y(cè)定方法主要有菲林試劑法、高效液相色譜法和DNS法。本實(shí)驗(yàn)主要采用DNS法來測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮俊?（1） 溶液的配制 DNS顯色劑：準(zhǔn)確稱取酒石酸鉀鈉182 g、重蒸餾酚4 g、無水亞硫酸鈉3 g、氫氧化鈉20 g，3,5二硝基水楊酸6.3 g，加水溶解以后定溶到1000 ml。將配置好的溶液倒入棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取100 mg葡萄糖，用少量蒸餾水溶解后定容至1000 ml。 （2） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取9只試管，編號(hào)為19。分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于8只試管中，加入1 ml的蒸餾水，然后分別加入DNS試劑1.5 mL。將各試管中的溶液混合均勻，放置于水浴鍋中100加熱5 min，取出后立即用流動(dòng)冷水冷卻至室溫，再向各試管中加入21.5 ml蒸餾水，混合均勻。在540 nm光波波長(zhǎng)下，用1號(hào)試管內(nèi)的溶液調(diào)零，分別測(cè)量28號(hào)試管內(nèi)溶液的吸光度值，其添加量如表2.1所示。表2-1 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)各試劑用量 項(xiàng)目12345678含糖總量(mg)00.20.40.60.81.01.21.4葡萄糖液(ml)00.20.40.60.81.01.21.4蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.6DNS試劑(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.5加熱沸水浴中加熱5min冷卻立即用流動(dòng)冷水冷卻蒸餾水(ml)21.521.521.521.521.521.521.521.5吸光度(540nm)00.2180.4010.5880.7630.9471.1231.338 以葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2-1)。 圖2-1 還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線 由上圖可知標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=0.9438x+0.0179 R2=0.9992 （3）發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y(cè)定將發(fā)酵液離心過濾后稀釋至合適的倍數(shù)(n)，取1.0 mL稀釋后的發(fā)酵液，并用移液槍吸取蒸餾水1.0 ml放置于25 mL的刻度試管中混合，加入1.5 mL DNS，沸水浴加熱5 min，迅速冷卻后加水至25 mL，搖勻，于分光光度計(jì)540 nm下測(cè)其吸光值。 還原糖含量= Xn式中：n為發(fā)酵液稀釋倍數(shù)；X為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)于吸光度的x軸值。 6.3 發(fā)酵液中生物量的測(cè)定先將發(fā)酵液過濾后的菌絲體用稀鹽酸充分洗滌，除掉過量的碳酸鈣，再用蒸餾水洗滌23次，放置于6080干燥箱中烘干至重量不在變化后稱量22，并計(jì)算出菌體的干重(g/L)。7 實(shí)驗(yàn)步驟（1）每小組配制菌株保藏培養(yǎng)基200 ml、調(diào)整pH為7.0，進(jìn)行滅菌，滅菌條件：12115分鐘。滅菌結(jié)束后將培養(yǎng)基置于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行冷卻， 待培養(yǎng)基冷卻后挑取菌絲接種到培養(yǎng)基表面，進(jìn)行菌株活化，培養(yǎng)條件：30培養(yǎng)3-4天。（2）配制種子培養(yǎng)基200 ml，調(diào)整pH為7.0，進(jìn)行滅菌，滅菌條件：12115分鐘。將活化后的米根霉置于無菌操作臺(tái)中，加入無菌水，用接種環(huán)將孢子刮下，制成孢子懸浮液，然后將其稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?一般為110個(gè)/L)，加入到已經(jīng)配置好的種子培養(yǎng)基，接種量按發(fā)酵液的5 %添加。最后置于30，200 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)。（4）配制發(fā)酵培養(yǎng)基1500ml，清洗發(fā)酵罐，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，然后再組裝發(fā)酵罐。將種、裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐、無菌水及其它需要滅菌的材料進(jìn)行滅菌，滅菌條件：12115分鐘，滅菌結(jié)束后將罐取出，及時(shí)通入無菌空氣，以保持罐內(nèi)正壓，防止染菌，并通入循環(huán)水，使發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻到30左右。（3）待種子培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后將其轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐進(jìn)行罐發(fā)酵，設(shè)置攪拌速度、通氣量、培養(yǎng)溫度等參數(shù)。（4）隨時(shí)關(guān)注發(fā)酵運(yùn)行過程，在發(fā)酵進(jìn)行過程中，每隔4h取樣，測(cè)定DCW、殘?zhí)桥c乳酸含量。（5）待發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐進(jìn)行拆卸并清洗實(shí)驗(yàn)相關(guān)設(shè)備，然后再將罐進(jìn)行復(fù)原。7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論由圖可知，米根霉利用葡萄糖為碳源時(shí)(質(zhì)量濃度為80 g/L)，在剛開始發(fā)酵的一個(gè)時(shí)間段內(nèi)，此時(shí)菌體還處于生長(zhǎng)的延滯期，產(chǎn)乳酸能力不強(qiáng)，因而發(fā)酵液中L-乳酸的含量很低。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在1836 h，米根霉進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，米根霉生長(zhǎng)加速，菌體迅速增加，達(dá)到3.6 g/L。此時(shí)發(fā)酵液中L-乳酸的產(chǎn)量也隨著米根霉菌體的大量增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，達(dá)到45 g/L，同時(shí)，葡萄糖含量急劇下降，由80 g/L下降至22.8 g/L。當(dāng)發(fā)酵至36 60 h時(shí)，米根霉菌株的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，米根霉的生物量達(dá)到4.0 g/L。由于發(fā)酵液中的葡萄糖含量比較低，所以米根霉產(chǎn)L-乳酸的速率明顯降低，乳酸含量由45.04 g/L增長(zhǎng)到58.93 g/L。在發(fā)酵至66