[討論]內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的應(yīng)用.doc

討論內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法的應(yīng)用內(nèi)標(biāo)法：選擇適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，定量加入被測(cè)樣品中，跟據(jù)被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積之比，乘以校正因子，對(duì)映內(nèi)標(biāo)物質(zhì)加入量所進(jìn)行含量測(cè)定方法。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：色譜條件對(duì)結(jié)果影響不大，準(zhǔn)確度、精度較高；缺點(diǎn)：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)比教困難。外標(biāo)法：又稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，依照測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品所繪制的曲線(xiàn)來(lái)計(jì)量被測(cè)樣品的含量的方法。外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，適和大量樣品分析。缺點(diǎn)：每次色譜條件很難相同，容易出現(xiàn)誤差。請(qǐng)問(wèn)大家在做含量測(cè)定時(shí)依照什么原則來(lái)選定方法的？我們一般作體外藥物分析時(shí)均采用外標(biāo)法，體內(nèi)藥物分析，因提取步驟煩瑣，都采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正，但如果儀器穩(wěn)定、方法的重現(xiàn)性好，也可使用外標(biāo)法，國(guó)外體內(nèi)藥物分析用外標(biāo)法的也有不少，但本人認(rèn)為最好使用內(nèi)標(biāo)法。實(shí)際樣品檢測(cè)用外標(biāo)法的更多。原因：1.內(nèi)標(biāo)物難獲得，特別是同位素標(biāo)記的有相近行為的內(nèi)標(biāo)物；2.操作步驟多、計(jì)算煩瑣如在新藥報(bào)批中使用內(nèi)標(biāo)物，則需報(bào)送內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)確證資料，在報(bào)生產(chǎn)的同時(shí)還要報(bào)送此內(nèi)標(biāo)物對(duì)照品。所以現(xiàn)在連SDA的專(zhuān)家都不推薦使用內(nèi)標(biāo)法。最初使用內(nèi)標(biāo)是因?yàn)檫M(jìn)樣器進(jìn)樣不準(zhǔn)確，采用內(nèi)標(biāo)可以校正進(jìn)樣誤差?，F(xiàn)在的HPLC用定量環(huán)進(jìn)樣準(zhǔn)確度很高，加了內(nèi)標(biāo)有時(shí)候因?yàn)椴僮鞯恼`差反而降低準(zhǔn)確度。在藥物質(zhì)量檢驗(yàn)中，如果是原料藥，或者制劑的成份不很多，用外標(biāo)法即可，不一定非要用內(nèi)標(biāo)法，而且現(xiàn)在越來(lái)越多的標(biāo)準(zhǔn)都放棄了用內(nèi)標(biāo)法。對(duì)于體內(nèi)藥物分析，分析方法的誤差反而不是那么的重要，而在樣品處理的過(guò)程中引入的誤差要引起足夠的重視，所以，一般在處理過(guò)程中加入內(nèi)標(biāo)以校正誤差。這個(gè)時(shí)候，回收率的高低又不是絕對(duì)的要求很高，雖然要求絕對(duì)回收率在70%或者80%以上，但是，有時(shí)候低一些也無(wú)所謂，關(guān)鍵是回收率的穩(wěn)定性，測(cè)定的重現(xiàn)性。歡迎行家指點(diǎn)：）-卻是如此，我剛剛做完體內(nèi)藥物分析，內(nèi)標(biāo)法卻是比較麻煩-個(gè)人認(rèn)為體內(nèi)分析應(yīng)該用內(nèi)標(biāo)法，否則結(jié)果不準(zhǔn)確。-但藥典中一些原料藥和制劑用的還是內(nèi)標(biāo)法-一般內(nèi)標(biāo)法能夠消除進(jìn)樣量不準(zhǔn)造成的系統(tǒng)誤差，在采用自動(dòng)進(jìn)樣器的前提下，這兩種方法的精密度差別并不大。但是，建立內(nèi)標(biāo)法色譜條件明顯要麻煩些，所以在采用自動(dòng)進(jìn)樣器的儀器上，盡可以采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。藥典中采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定的往往是一些老的品種，現(xiàn)在一般的趨勢(shì)是采用外標(biāo)法測(cè)定。實(shí)際上，內(nèi)標(biāo)法中需要對(duì)兩個(gè)色譜峰進(jìn)行積分同樣也會(huì)引起誤差增大的-體內(nèi)藥物分析，特別是需要提取步驟的，加入內(nèi)標(biāo)可消除提取過(guò)程帶來(lái)的偶然誤差，內(nèi)標(biāo)一定要在提取前加入到樣品中并要混合均勻后再加入提取液，如此操作使提取的系統(tǒng)誤差大大降低。內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)一定要與目的物相似。-很同意inferno的觀(guān)點(diǎn)，內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法各有千秋，我正在做體內(nèi)成分的測(cè)定，因內(nèi)標(biāo)物與代測(cè)成分是在是分不開(kāi)，再加上我的樣品處理方法比較簡(jiǎn)單，所以就采用了外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法。-我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持啊我支持-很受用謝謝！-各位老師，外標(biāo)法需要注意什么啊-內(nèi)標(biāo)有它的優(yōu)點(diǎn)，可尋找合適的內(nèi)標(biāo)物比較困難，特別是在沒(méi)有已有文獻(xiàn)時(shí)，能不用內(nèi)標(biāo)就不用內(nèi)標(biāo)，盡量先優(yōu)化制樣方法。-總結(jié)的很好，我主要用液相做西藥的含量測(cè)定，都是用外標(biāo)法，操作很簡(jiǎn)單，容易。去年還做了一個(gè)人體生物等效性試驗(yàn)，用液-質(zhì)聯(lián)用法，內(nèi)標(biāo)法。 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的不同情況應(yīng)用，感覺(jué)當(dāng)儀器響應(yīng)變化很大時(shí)，必須選用內(nèi)標(biāo)法，否則測(cè)定就沒(méi)有意義了。-我談?wù)勎业目捶?內(nèi)標(biāo)法是以前針對(duì)儀器的不穩(wěn)定和進(jìn)樣的誤差較大而設(shè)定的,其在克服儀器,環(huán)境因素方面有獨(dú)到之處,但對(duì)于找到合適內(nèi)標(biāo)物仍是較大難題.這不用我多說(shuō).但對(duì)于現(xiàn)在儀器條件,有時(shí)內(nèi)標(biāo)不如外標(biāo),我從方法準(zhǔn)確方面談?wù)勎业目捶?在用外標(biāo)法做含量測(cè)定時(shí),藥典采用多種限制條件來(lái)控制方法誤差,如系統(tǒng)適應(yīng)性,控制供試與對(duì)照濃度的差異范圍等.系統(tǒng)適應(yīng)性用來(lái)判定儀器能否達(dá)到穩(wěn)定要求,一半waters和agllent的連續(xù)進(jìn)樣誤差在1%以?xún)?nèi),自動(dòng)進(jìn)樣就更不用說(shuō)了.達(dá)到要求時(shí),其儀器部件特別是件測(cè)器表明已穩(wěn)定,可以進(jìn)樣.通過(guò)控制供試與對(duì)照濃度的差異范圍是通過(guò)減少標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不完全過(guò)圓點(diǎn)造成的方法誤差.1.一般外標(biāo)法的步驟為對(duì)照供試各2份,每份2針,取平均計(jì)算.其誤差為(4*0.2%(稱(chēng)量)+4*0.2%(稀釋)+2%(儀器)*4)/2=4.8%.內(nèi)標(biāo)法為兩份各一針,其誤差為2*0.2%(稱(chēng)量)+2*0.2%(一次稀釋)+0.2%(轉(zhuǎn)移)+0.2%(二次稀釋)+2*2%(儀器)=5.2%,如果儀器誤差很小或在1%以?xún)?nèi)時(shí),可以看出內(nèi)標(biāo)對(duì)外標(biāo)的相對(duì)誤差要大.內(nèi)標(biāo)相對(duì)外標(biāo)還有一次內(nèi)標(biāo)物的轉(zhuǎn)移和稀釋所多造成的人為誤差,且無(wú)法通過(guò)重復(fù)取平均來(lái)消除.其人為因素影響占較大成分.在儀器高度發(fā)達(dá)的今天,儀器的誤差已經(jīng)在人為誤差之下.所以其為準(zhǔn)確度不如外標(biāo)的主要原因.2.在測(cè)定含量時(shí),內(nèi)標(biāo)法還有內(nèi)標(biāo)物與供試雜質(zhì)或雜峰重疊的風(fēng)險(xiǎn),此時(shí)內(nèi)標(biāo)定量也不如外標(biāo)準(zhǔn)確.3.做體內(nèi)藥分時(shí),在處理前加內(nèi)標(biāo),也存在內(nèi)標(biāo)物與血槳結(jié)合,萃取損失等缺點(diǎn),且同樣與待測(cè)物一樣,重復(fù)性不佳,也無(wú)法保證每次處理內(nèi)標(biāo)與待測(cè)物的回收比率一致,這時(shí)就不如外標(biāo)的實(shí)跡值準(zhǔn)確,因?yàn)樵诙ǚ椒〞r(shí),其可能損失已經(jīng)有回收率應(yīng)大于.這個(gè)指標(biāo)來(lái)控制.4.單個(gè)誤差比較.在選取色譜條件時(shí)(尤其是氣相),其很多參數(shù)是依據(jù)待測(cè)物來(lái)定,在制定其檢測(cè)條件時(shí),其待測(cè)物的耐受性一般是要驗(yàn)證的,以保證其個(gè)人,儀器,實(shí)驗(yàn)室間的誤差,在此條件下,其方法對(duì)于內(nèi)標(biāo)物,其耐受性一般均不會(huì)優(yōu)于待測(cè)物,即其在儀器變化的影響,內(nèi)標(biāo)大于待測(cè)物,其內(nèi)標(biāo)就不如外標(biāo)方法穩(wěn)定.我做氣相時(shí)就經(jīng)常因溫度對(duì)內(nèi)標(biāo)的揮發(fā)和聚集不利而導(dǎo)致校正因子誤差很大,所以評(píng)判時(shí)要看其使用的對(duì)象,具體問(wèn)題具體分析.以上是個(gè)人愚見(jiàn),歡迎指正!下載文檔收藏歸一化法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法的區(qū)別 分析化學(xué) 分析化學(xué)隱藏 色 譜 定 量 方 法 一、歸一化法 由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分 都能產(chǎn)生信號(hào)，得到相應(yīng)的色譜峰，那么可以用如下歸一化 公式計(jì)算各組分的含量。 (7.34) 若樣品中各組分的校正因子相近，可將校正因子消去， 直接用峰面積歸一化進(jìn)行計(jì)算。中國(guó)藥典用不加校正因子的 面積歸一化法測(cè)定藥物中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度。 (7.35) 歸一化法的優(yōu)點(diǎn)是：簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、定量結(jié)果與進(jìn)樣量重 復(fù)性無(wú)關(guān)(在色譜柱不超載的范圍內(nèi))、操作條件略有變化時(shí) 對(duì)結(jié)果影響較小。 缺點(diǎn) 是：必須所有組分在一個(gè)分析周期內(nèi)都流出色譜柱，而且檢測(cè)器對(duì)它們都產(chǎn)生信號(hào)。不適于微量雜質(zhì)的含量 測(cè)定。 二、外標(biāo)法 用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待 測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱(chēng)為外標(biāo)法。此法 可分為工作曲線(xiàn)法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線(xiàn)法是用對(duì)照物 質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線(xiàn)，求出斜率、 截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體 積的樣品溶液，根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其 濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線(xiàn)法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法 代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說(shuō)明存在系統(tǒng)誤差。工 作曲線(xiàn)的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法)定量。 外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品 溶液中 i 組分的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件 下多次進(jìn)樣，測(cè)得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中 i 組 分的量： W A (W ) (A ) (7.36) 式中 W 與 A 分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含 i 組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W ) 及(A ) 分別代表在對(duì)照品 溶液進(jìn)樣體積中含純品 i 組分的重量及相應(yīng)峰面積。 外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便，不需用校正因子，不論樣品中其他組 分是否出峰，均可對(duì)待測(cè)組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣 重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn) 法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中 組分的濃度相近。 三、內(nèi)標(biāo)法 選擇樣品中不含有的純物質(zhì)作為對(duì)照物質(zhì)加入待測(cè)樣 品溶液中，以待測(cè)組分和對(duì)照物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào)對(duì)比，測(cè)定待 測(cè)組分含量的方法稱(chēng)為內(nèi)標(biāo)法。 “內(nèi)標(biāo)”的由來(lái)是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)(對(duì) 照)物質(zhì)加入到樣品中，有別于外標(biāo)法。該對(duì)照物質(zhì)稱(chēng)為內(nèi)標(biāo) 物。 在一個(gè)分析周期內(nèi)不是所有組分都能流出色譜柱(如有 難氣化組分)，或檢測(cè)器不能對(duì)每個(gè)組分都產(chǎn)生信號(hào)，或只需 測(cè)定混合物中某幾個(gè)組分的含量時(shí)，可采用內(nèi)標(biāo)法。 準(zhǔn)確稱(chēng)量 W 克樣品，再準(zhǔn)確稱(chēng)量 W 克內(nèi)標(biāo)物，加入至 樣品中，混勻，進(jìn)樣。測(cè)量待測(cè)組分 i 的峰面積 A 及內(nèi)標(biāo)物 的峰面積 A ，則 i 組分在 W 克樣品中所含的重量 W ，與內(nèi) 標(biāo)物的重量 W ，有下述關(guān)系： (7.37) 待測(cè)組分 i 在樣品中的百分含量 C 為： (7.38) 對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求；內(nèi)標(biāo)物是原樣品中不含有的組分， 否則會(huì)使峰重疊而無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物的峰面積；內(nèi)標(biāo)物 的保留時(shí)間應(yīng)與待測(cè)組分相近，但彼此能完全分離(R1.5)； 內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是：在進(jìn)樣量不超限(色譜柱不超載)的 范圍內(nèi)