淺談醫(yī)學(xué)生物材料-膠原蛋白.doc

淺談醫(yī)學(xué)生物材料-膠原蛋白生醫(yī)高分子材料（biomedical polymers）系指應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域之合成（synthetic）或天然（natural）高分子材料。天然高分子材料中目前最具發(fā)展?jié)摿Φ挠袔锥≠|(zhì)（chitin）、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid）及膠原蛋白（collagen）等。其中，幾丁質(zhì)是由蟹殼中抽取的，而透明質(zhì)酸是從雞冠中抽取而得，兩者都屬多醣體（polysaccharide）類生醫(yī)高分子材料。膠原蛋白又稱作膠原質(zhì)，是組成各種細(xì)胞外間質(zhì)的聚合物，在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色。更進(jìn)一步而言，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)最重要的組成份，同時(shí)也是動(dòng)物結(jié)締組織（connective tissue）中最主要的構(gòu)造性纖維蛋白質(zhì)。它主要是以不溶性纖維蛋白的形式存在，在人體的組成中約占蛋白質(zhì)的2530，扮演著有如建構(gòu)房屋之鷹架的角色，提供組織張力藉以保護(hù)并連結(jié)各種組織，支撐起人體的結(jié)構(gòu)(1)。膠原蛋白為脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)（protein），在骨頭（bone）與肌腱（tendon）中約有90%以上，皮膚中約有50%以上的蛋白質(zhì)為膠原蛋白，不僅脊椎動(dòng)物有，無脊椎動(dòng)物如軟件、節(jié)足動(dòng)物也有膠原蛋白。多年以來的研究指出，由不同種類的動(dòng)物萃取而得之膠原蛋白具有高度的一致性，就是說我們可由同一動(dòng)物的不同組織中得到相同之膠原蛋白，這些膠原蛋白的基本型態(tài)、螺旋結(jié)構(gòu)及胺基酸的組成份都相同。膠原蛋白種類及結(jié)構(gòu)隨著萃取及分析技術(shù)不斷的進(jìn)步，現(xiàn)在根據(jù)發(fā)現(xiàn)的時(shí)間先后已定義出21種不同形式的膠原蛋白，其中人類第21型膠原蛋白體為工研院生醫(yī)中心技術(shù)團(tuán)隊(duì)于2001年發(fā)現(xiàn)。各種型態(tài)膠原蛋白在生化特性、組織中的分布、合成機(jī)制以及在胚胎期、成年期的結(jié)構(gòu)與功能上所扮演的不同角色，是現(xiàn)在許多研究的重點(diǎn)。但目前一般在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用仍以Type I 膠原蛋白為主，故若未特別標(biāo)示其形式者，則通常是指Type I 膠原蛋白。膠原蛋白分子是由三條多勝月太鏈（polypeptides）所組成的三股螺旋結(jié)構(gòu)（triple-helical structure），而每一條多勝月太鏈（我們稱之為chain）的組成相似，但并不一定完全相同，故所組成的膠原蛋白也不相同。有的是由三條完全相同之chain所組成（如Type II），有的三條chain完全不同（如Type VI），有的則是兩條相同而另一條不同，Type I便屬于這一種。體內(nèi)不同部位組織蘊(yùn)藏不同含量及型態(tài)的膠原蛋白，表一中顯示了這些膠原蛋白的形式、組成與一般在體內(nèi)的分布情形。表一 膠原蛋白的型式及組成膠原蛋白型態(tài) 組成 體內(nèi)分布I 1(I) 2 2(I) 骨頭，肌腱，皮膚，血管壁，心瓣膜，角膜II 1(II)3 軟骨，玻璃體，背索III 1(III)3 肌肉，皮膚，血管壁，心瓣膜，角膜（一般與Type I 并存，骨頭，肌腱，角膜除外）IV 1(IV)22(IV) 基底膜V 1(V)2(V)3(V)or 1(V)22(V)or 1(V)3 大部份的空隙組織VI 1(VI)2(VI)3(VI) 大部份的空隙組織VII 1(VII)3 Anchoring fibrilsVIII 1(VIII)3(chainor ganization of helix unknown) 一些內(nèi)皮細(xì)胞IX 1(IX)2(IX)3(IX) 軟骨X 1(X)3 軟骨XI 1(XI)2(XI)3(XI) 軟骨資料來源：Biomaterials (Editor David Byrom)Type I 膠原蛋白為骨頭、肌腱及皮膚的主成份，其三股螺旋結(jié)構(gòu)是由兩條1(I) （含1,056個(gè)胺基酸）及一條2(I)（含1,029個(gè)胺基酸）的多勝月太鏈所構(gòu)成，在這些多勝月太鏈上每三個(gè)胺基酸便有一甘胺酸（glycine），而脯胺酸（proline）及羥基脯胺酸（hydroxyproline）的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與氫鍵使三股螺旋穩(wěn)定，若因熱或化學(xué)物質(zhì)破壞這些鍵結(jié)而使分子的螺旋結(jié)構(gòu)展開則稱變性（denaturation）。膠原蛋白分子的分子量約為283,000 daltons，長約280 nm，直徑1.4 nm(1)，兩端非螺旋結(jié)構(gòu)的部份（稱之為telopeptides）在合成機(jī)制上有其意義，但在生醫(yī)材料的應(yīng)用上則會(huì)引起免疫反應(yīng)，結(jié)構(gòu)圖如圖一所示。在體內(nèi)的細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白分子不會(huì)單獨(dú)存在，而是聚集成纖維，當(dāng)細(xì)纖維形成后，多勝月太鏈上的羥基脯胺酸及離胺酸（lysine）會(huì)與酵素作用，產(chǎn)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)（crosslinking）而加強(qiáng)支撐功能，纖維并會(huì)隨著年齡增加而加粗至直徑約50300 nm(2)。圖一 膠原蛋白結(jié)構(gòu)膠原蛋白之生物學(xué)特性膠原蛋白具有特別的機(jī)械性質(zhì)如抗拉強(qiáng)度（例如，具方向性的膠原蛋白纖維抗拉強(qiáng)度可高達(dá)510 kg/mm2）與生化性質(zhì)（如，促使血小板聚集而催化血塊的形成）。且膠原蛋白可在體內(nèi)自然分解，生物兼容性佳，低毒性、含量豐富，可多方應(yīng)用的性質(zhì)及易于改質(zhì)與制造的特性使得膠原蛋白成為一種重要而理想之天然高分子生醫(yī)材料，因此，膠原蛋白生醫(yī)材料的發(fā)展是一門新且迅速并結(jié)合了高分子科學(xué)、生化、生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)的綜合學(xué)科。膠原蛋白具備了高抗拉強(qiáng)度、可控制的生物分解性、止血性、低抗原性、低發(fā)炎性、低毒性及促進(jìn)細(xì)胞附著生長的特性，在醫(yī)學(xué)上可做廣泛的應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)歸納如下：(1)天然高分子材料來源豐富；(2)高生物兼容性（biocompatible）；(3)生物可分解性（biodegradable）；(4)低抗原性（non-antigenic）；(5)低毒性（non-toxic）；(6)高抗拉強(qiáng)度（tensile strength）；(7)止血性（hemostatic）；(8)促進(jìn)細(xì)胞貼附生長；(9)可經(jīng)化學(xué)改質(zhì)成各種型態(tài)；(10)可制備成各種型態(tài)（membranes, films, sponges, and beads）。膠原蛋白之萃取純化膠原蛋白溶解于酸液，當(dāng)溶液中鹽類濃度達(dá)到一定量時(shí)會(huì)被鹽析沈淀，利用這種特性，可以將膠原蛋白自組織分離純化出來，純化的步驟雖不盡相同，但大抵依照上述之原則，重復(fù)以酸溶解、鹽析、離心達(dá)到萃取純化之目的。純化時(shí)通常以0.5M的醋酸溶液，或鹽類濃度低于1.0M的緩沖溶液溶解膠原蛋白，當(dāng)0.5M的醋酸溶液中含有1.0M以上鹽類，或中性緩沖液中鹽類濃度高達(dá)2.0M以上時(shí)，膠原蛋白會(huì)鹽析析出。此外，為去除膠原蛋白可能造成的免疫排斥反應(yīng)，通常會(huì)在純化過程加入酵素（如胃蛋白酉每），藉以去除膠原分子兩端之登錄勝月太鏈（registration peptide），去除免疫端的膠原蛋白分子，再回溫重組所形成的膠原蛋白纖維，經(jīng)電子顯微鏡觀察，比較溶液產(chǎn)生扭轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，較不易發(fā)現(xiàn)分子間交互重迭時(shí)特有的明暗帶(3)。純化萃取而得的膠原蛋白溶液一般都保存于0以下，要使用時(shí)再取出回溫重組，雖然膠原蛋白重組是一自發(fā)（spontaneous）現(xiàn)象，但在不同的條件下，重組的膠原蛋白纖維卻不相同。Wood與Keech曾就膠原蛋白溶液重組時(shí)溶液濃度、pH值、離子強(qiáng)度與溫度等條件，對重組后膠原蛋白纖維尺寸，做過一系列研究探討，研究結(jié)果顯示當(dāng)離子強(qiáng)度越強(qiáng)，形成的纖維越粗，重組時(shí)pH愈高，所得的纖維愈細(xì)，而重組的溫度越高纖維越細(xì)；但是膠原蛋白溶液濃度對重組的尺寸并不會(huì)造成影響(4, 5)。膠原蛋白材料之加工制備與生醫(yī)應(yīng)用膠原蛋白可重組或經(jīng)處理成多種型態(tài)，如薄膜、管狀、海綿狀、粉末或柔軟的纖維織品（如圖二所示），目前已有應(yīng)用在止血材、神經(jīng)重建、組織整型、燒燙傷敷料、脫腸修補(bǔ)、尿道手術(shù)、藥物釋放、眼科、陰道避孕器、修補(bǔ)心瓣膜、血管壁手術(shù)及手術(shù)縫線等生醫(yī)材料上，如表二所示。圖二 各種型態(tài)之膠原蛋白在植入式及敷料上最常用的膠原蛋白來源為動(dòng)物的皮膚及肌腱，外科縫線則最常用動(dòng)物的內(nèi)臟黏膜。而一般在應(yīng)用上最常使用的膠原蛋白型態(tài)可為纖維狀（fibrillar）、管狀（tublar）、多孔狀（porous）、薄膜（membrane）、海綿狀（sponge）及注射劑（injectables）。進(jìn)一步簡述各種型態(tài)膠原蛋白的制法，如：多孔性膠原蛋白海綿為膠原蛋白在酸中膨潤（swollen），攪成泥狀后冷凍干燥而得；膠原蛋白薄膜做法與上述方法相似，但干燥法采自然干燥（air drying）；注射用膠原蛋白則是由牛皮純化并經(jīng)酵素切除免疫端，再離心后取上層液以緩沖液稀釋并將pH調(diào)成中性，形成無菌的注射液。表二 各種型態(tài)之膠原蛋白及其在醫(yī)學(xué)上之應(yīng)用膠原蛋白型態(tài) 相關(guān)醫(yī)學(xué)應(yīng)用溶液（solution） 藥物釋放載體（vehicle for drug delivery）、軟組織修復(fù)注射液凝膠（gel） 玻璃體（vitreous body）、軟及硬組織修復(fù)、藥物及生物活性大分子傳輸粉末狀（powder） 止血材（hemostat）薄膜（film） 人工皮膚（artificial skin）、人工角膜（cornea）、透析膜、敷傷材料、牙周?。╬eriodontal）治療、藥物釋放海綿狀（sponge） 敷傷材料、燒燙傷敷料、藥物釋放、止血材、組織培養(yǎng)基材（scaffod）管狀（tube） 人工血管（vessel prostheses）絲狀（filament） 神經(jīng)修復(fù)、肌腱修復(fù)、縫合線（sutures）一般膠原蛋白生醫(yī)材料產(chǎn)品制備必須經(jīng)交聯(lián)（crosslinking）處理以加強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度。在天然組織如皮膚、肌腱中的膠原蛋白具有很高的濕抗拉強(qiáng)度（wet tensile strength）及抗酵素水解的能力（因?yàn)橛蟹肿觾?nèi)與分子間之交聯(lián)而使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定）。其中，經(jīng)溶解再重組后形成膜（film, membrane）或海綿（sponge）的膠原蛋白即使在干燥時(shí)抗拉強(qiáng)度很好，但是浸濕膨潤后也不一定具有足夠良好的抗拉強(qiáng)度及抗酵素水解的能力，因此須加以交聯(lián)處理。膠原蛋白的交聯(lián)反應(yīng)通常發(fā)生在多勝月太鏈上天冬胺酸（aspartic acid）及谷胺酸（glutamic acid）上之羰基（carboxyl groups）或離胺酸（lysine）及羥基離胺酸（hydroxylysine）上之胺基，但很少發(fā)生在羥基上，例如絲胺酸（serine）、羥丁胺酸（threonine）及羥基脯胺酸。膠原蛋白交聯(lián)反應(yīng)，依其化學(xué)鍵結(jié)不同，可區(qū)分為離子鍵結(jié)及共價(jià)鍵結(jié)，分述如下：1.離子鍵結(jié)形成離子鍵常用的交聯(lián)劑為三價(jià)金屬離子如鉻（Cr3+），但其硫酸鹽（sulfate）或單獨(dú)的鉻化合物并無法使膠原蛋白分子形成交聯(lián)，必須加入堿使鉻硫酸鹽聚合形成以氧及硫酸根連接的寡聚物（oligomer）后作為兩羰基間之架橋，而使膠原蛋白分子間產(chǎn)生交聯(lián)。其它多價(jià)陽離子如Al3+等也可與膠原蛋白形成離子鍵，但穩(wěn)定性都不如鉻。2.共價(jià)鍵結(jié)共價(jià)鍵則可由下列幾種方式形成：以醛類、碳二亞胺、異氰酸鹽及氫硼化物為交聯(lián)劑或脫水加熱（dehydrothermal）等方式進(jìn)行交聯(lián)，略述如下。許多醛類都可與膠原蛋白上離胺酸之胺基反應(yīng)，其中以戊二醛（glutaraldehyde, GA）最常用，因?yàn)橹挥形鍌€(gè)碳的二醛可產(chǎn)生化學(xué)、生化及熱穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而低濃度的GA交聯(lián)效果比高濃度好，因?yàn)楦邼舛鹊奈於?huì)接在膠原蛋白纖維的表面而無法滲透至纖維及細(xì)纖維間，反應(yīng)時(shí)pH值應(yīng)在78間最佳。另外，碳二亞胺的反應(yīng)使膠原蛋白上的羰基及一級胺基間形成酰胺鍵結(jié)（amide linkages），而碳二亞胺反應(yīng)后形成水溶性的isourea，可輕易水洗掉。常用的異氰酸鹽為hexamethylene diisocyanate，可使膠原蛋白海綿交聯(lián)產(chǎn)生很強(qiáng)的抵抗力。氫硼化物常被用于穩(wěn)定膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，因?yàn)橛赡贻p動(dòng)物皮膚取出的膠原蛋白，主要分子間的共價(jià)交聯(lián)對酸及熱并不穩(wěn)定。除上述化學(xué)交聯(lián)劑外，另一種常用于產(chǎn)生共價(jià)鍵的交聯(lián)方法為在真空下加熱，加熱會(huì)降低溶解度，并使膠原蛋白的羰基及胺基形成酰胺鍵結(jié)，而加熱前需先干燥，若有水即使少許也會(huì)造成膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的分裂或水解，較有效的方法是利用緩慢的增溫來去水，在真空下可幫助此過程，此法已被應(yīng)用于制造collagen-based 創(chuàng)傷敷料上(6, 7)。國內(nèi)外市場分析及研發(fā)現(xiàn)況膠原蛋白系一種自動(dòng)物體內(nèi)分離、純化出之高附加價(jià)值天然生物材料（Natural Biomaterial），現(xiàn)今已廣泛應(yīng)用作為高級醫(yī)材產(chǎn)品，如Soft tissue augmentation, Cardiovascular coating material, orthopaedic surgery, Hemostats, Wound dressing, Drug Delivery等醫(yī)用產(chǎn)品，亦同時(shí)大量應(yīng)用在化妝品（cosmetic）領(lǐng)域。膠原蛋白材料衍生產(chǎn)品產(chǎn)值于美國地區(qū)1996年約為810億美元/年，年成長率約為812%，國內(nèi)膠原蛋白材料衍生產(chǎn)品產(chǎn)值約為34億臺幣/年，年成長率亦為812%之間。膠原蛋白材料由于本質(zhì)上為一種天然生物材料，經(jīng)由分離、純化程序，再加上配合適當(dāng)酵素作用（例如Pepsin）可將膠原蛋白免疫成份去除，而可得到生物組織兼容性良好之膠原蛋白生醫(yī)材料，并可透過數(shù)種型態(tài)重組及化學(xué)交聯(lián)技術(shù)及