「血清蛋白電泳[課件參考]」.ppt

血清蛋白電泳 SerumProteinElectrophoresis 精選課件 血清和血漿 血清 是指離體的血液經(jīng)過(guò)自然凝固而析出的液體部分 血漿 是指離體并經(jīng)過(guò)抗凝的血液經(jīng)過(guò)離心沉淀后的上清部分 血清中無(wú)纖維蛋白原 精選課件 簡(jiǎn)介 人類血液中有125種以上蛋白質(zhì)成分 白蛋白 脂蛋白 抗體 補(bǔ)體 凝血酶原和凝血因子 抗凝血因子 1 抗胰蛋白 1 糖蛋白 2 巨球蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白和其他微量蛋白等成分 精選課件 歷史 1809年 Pehce 俄國(guó)物理學(xué)家 首先發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年 Tiselius 瑞典 制成界面電泳儀 應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究1948年 Wieland和Fischer建立了濾紙電泳法 奠定了區(qū)帶電泳技術(shù)的基礎(chǔ)1959年 Raymond和Weintraub創(chuàng)建聚丙烯酰胺凝膠電泳 精選課件 電泳和電泳技術(shù) 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下 向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象 電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù) 精選課件 應(yīng)用 電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外 最主要用于蛋白質(zhì) 核酸等生物分子的研究 由于電泳法設(shè)備簡(jiǎn)單 操作方便 具有高分辨率及選擇性特點(diǎn) 已成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的技術(shù) 精選課件 COO COO COOH H H Pr Pr Pr OH OH NH2NH3 NH3 PH PIPH PIPH PI 電泳用于分離物質(zhì)的原理 精選課件 電泳分類 按分離的原理不同 區(qū)帶電泳 自由界面電泳 等速電泳 等電聚焦電泳按支持介質(zhì)的不同 紙電泳 醋酸纖維薄膜電泳 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳按支持介質(zhì)形狀不同 薄層電泳 板電泳和柱電泳按用途不同 分析電泳 制備電泳 定量免疫電泳和連續(xù)制備電泳 精選課件 影響電泳的因素 在電泳中 電場(chǎng) 帶電粒子和促使帶電粒子移動(dòng)的介質(zhì)是產(chǎn)生電泳的三大要素 因而 影響電泳的主要因素有 電場(chǎng)強(qiáng)度的影響溶液的pH值溶液的離子強(qiáng)度電滲溫度 分子大小 吸附作用等 精選課件 電滲 液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng) 由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷所引起 如果電滲與電泳方向相同 V變大 反之變小 精選課件 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳 精選課件 原理 在pH8 6堿性環(huán)境 血清蛋白均帶負(fù)電荷 在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)各種蛋白質(zhì)pI不同 帶電荷量有差異蛋白質(zhì)的分子大小與分子形狀不相同帶電荷多 分子量小者 泳動(dòng)較快 反之則較慢 精選課件 精選課件 電泳結(jié)果示意圖 2 1 清蛋白 精選課件 染色時(shí)染料與蛋白質(zhì)特異結(jié)合而不與醋纖膜結(jié)合 染色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比染色一段時(shí)間后脫色 將各蛋白區(qū)帶剪下 經(jīng)脫色 比色即可計(jì)算出各蛋白質(zhì)組分的相對(duì)百分?jǐn)?shù) 如同時(shí)測(cè)定出總蛋白濃度 還可計(jì)算出各蛋白組分的絕對(duì)濃度 精選課件 正常血清電泳掃描圖譜 精選課件 試劑 緩沖液 巴比妥緩沖液 pH8 6 染色液 麗春紅S染色液漂洗液 3 V V 醋酸溶液洗脫液 0 1mol LNaOH溶液 精選課件 操作 準(zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備CAM的準(zhǔn)備點(diǎn)樣吸3 5 l血清均勻點(diǎn)于CAM無(wú)光澤面電泳無(wú)光澤面朝下 點(diǎn)樣側(cè)置于負(fù)極端 通電染色將薄膜條浸入麗春紅S染色液 染5 10min漂洗 精選課件 醋纖膜規(guī)格及點(diǎn)樣示意圖 精選課件 定量 取試管6支 在白蛋白管內(nèi)加入0 1mol LNaOH液6ml 其余各管加入3ml 將各蛋白區(qū)帶剪下分別置于各試管中 另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中 37 10 20min向白蛋白管中加入40 醋酸0 6ml 其余各管加0 3ml 以中和部分NaOH用520nm比色 以空白管調(diào)零 讀各管吸光度 精選課件 計(jì)算 設(shè)各部吸光度分別為AA Aa1 Aa2 A A 吸光度總和 AT 為 AT AA Aa1 Aa2 A A 白蛋白 AA 2AT 100 a1 球蛋白 Aa1AT 100 精選課件 注意事項(xiàng) 通電時(shí) 不得接觸槽內(nèi)緩沖液或CAM 以防觸電緩沖液液面要保證一定高度標(biāo)本 血清應(yīng)新鮮 不得溶血染料 對(duì)蛋白質(zhì)的各組分親和力相同 水溶性好 穩(wěn)定 吸光度敏感 形成的染料蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定且易洗脫比色 精選課件 注意事項(xiàng) 電泳后區(qū)帶拖尾 各區(qū)帶分開(kāi)不明顯原因 點(diǎn)樣過(guò)多點(diǎn)樣不均勻 不整齊樣品觸及薄膜邊緣 薄膜過(guò)濕 樣品擴(kuò)散 薄膜未完全浸透或溫度過(guò)高導(dǎo)致干燥或水分蒸發(fā)薄膜與濾紙橋接觸不良薄膜位置歪斜 彎曲 與電流方向不平行緩沖液變質(zhì) 樣品不新鮮CAM質(zhì)量不高等電滲現(xiàn)象 精選課件 評(píng)價(jià) 優(yōu)點(diǎn) CAM電泳具有靈敏度高 標(biāo)本用量少 分辨率高 區(qū)帶清晰 電泳時(shí)間短 操作簡(jiǎn)便快捷 CAM對(duì)染料不吸附 蛋白區(qū)帶均勻 背景清晰 既易比色定量 又易透明后進(jìn)行光密度掃描 缺點(diǎn) 有輕微電滲現(xiàn)象 薄膜吸水性差 電阻容易增大 當(dāng)電流較大時(shí) 薄膜中水分極易蒸發(fā) 造成蛋白質(zhì)分子變性破壞 精選課件 臨床意義 精選課件 精選課件 各組分構(gòu)成 Alb 白蛋白 1 1酸性糖蛋白 1抗胰蛋白酶 甲胎蛋白 高密度脂蛋白 2 觸珠蛋白 銅蘭蛋白 2巨球蛋白 脂蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白 補(bǔ)體系統(tǒng) 脂蛋白 IgG IgM IgA IgD IgE CRP 精選課件 臨床意義 肝病型 Alb降低 和 球蛋白增高出現(xiàn) 和 難以分離 出現(xiàn) 橋 此現(xiàn)象往往是由于IgA增高所致 IgA與肝纖維化有關(guān) 見(jiàn)于急慢性肝炎和肝硬化 精選課件 臨床意義 M蛋白血癥型Alb輕度降低單克隆 球蛋白 M蛋白 增高在 與 球蛋白區(qū)或 球蛋白區(qū)出現(xiàn)一條致密濃集的M蛋白帶見(jiàn)于MM 巨球蛋白血癥等 精選課件 臨床意義 腎病型 表現(xiàn)為白蛋白及 球蛋白降低 2和 球蛋白升高 見(jiàn)于急慢性腎炎 腎病綜合征 腎功能衰竭等 炎癥型 表現(xiàn)為 1 2和 三種球蛋白均增高 見(jiàn)于各種急 慢性炎癥和應(yīng)激反應(yīng) 蛋白缺乏癥 主要包括 1抗胰蛋白酶缺乏癥 球蛋白缺乏癥等 較少見(jiàn) 精選課件 精選課件 雙白蛋白血癥型 主要特征 在白蛋白部位有兩個(gè)區(qū)帶 掃描出現(xiàn)雙峰 呈剪刀狀 產(chǎn)生原因 持久型主要是一種家族性血清蛋白異常的疾病 極少見(jiàn) 為常染色體不完全顯性遺傳 暫時(shí)型主要是指腎功能不全的患者在治療期間使用大劑量的 內(nèi)酰胺類抗生素 可形成快泳動(dòng)性的白蛋白成分 治療中斷即逐漸消失 精選課件 先天性白蛋白缺陷型 主要特征 由于血清白蛋白的顯著降低 血清總蛋白也隨之降低 1 2球蛋白明顯增高 球