人教版選修1 專(zhuān)題5 課題3 血紅蛋白的提取和分離 學(xué)案.doc

課題3血紅蛋白的提取和分離1了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。(重點(diǎn))2體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程與方法。(難點(diǎn))蛋 白 質(zhì) 分 離 的 原 理 和 方 法1分離蛋白質(zhì)的原理蛋白質(zhì)特性的差異2分離蛋白質(zhì)的方法(1)凝膠色譜法：概念：也稱(chēng)做分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠原理：相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢，因此可將各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分離。(2)電泳：概念：指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。原理：a許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的ph下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。b在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。c電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。方法：常用的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。3緩沖溶液(1)作用：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的酸和堿對(duì)溶液ph的影響，維持ph基本不變。(2)配制：由12種緩沖劑溶解于水中配制而成，通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以得到不同ph范圍內(nèi)使用的緩沖液。探討：凝膠色譜法分離過(guò)程是怎樣的？提示：蛋白質(zhì)混合物上柱洗脫大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢先收集大分子后收集小分子。探討：凝膠的成分是什么？凝膠有何特點(diǎn)？提示：成分：大多數(shù)是多糖類(lèi)化合物構(gòu)成的一些微小的多孔球體，如葡聚糖或瓊脂糖。特點(diǎn)：小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。1蛋白質(zhì)分離的依據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等，可以用來(lái)分離不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)。2蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆叫∮谀z顆?？障吨睆竭\(yùn)動(dòng)方式垂直向下運(yùn)動(dòng)無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路程較短較長(zhǎng)洗脫順序先從凝膠柱中洗脫出來(lái)后從凝膠柱中洗脫出來(lái)3.電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場(chǎng)中遷移速率決定于所帶電荷性質(zhì)的差異及分子的大小、形狀的不同在凝膠中加入sds，使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)sds復(fù)合物，使其遷移速率完全取決于分子的大小1利用凝膠色譜法先洗脫出來(lái)的蛋白質(zhì)是()a相對(duì)分子質(zhì)量大的b溶解度高的c相對(duì)分子質(zhì)量小的d所帶電荷多的【解析】相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)，路程較短，移動(dòng)速度較快，首先洗脫出來(lái)?！敬鸢浮縜2下列有關(guān)緩沖溶液的說(shuō)法，不正確的是()a緩沖溶液能夠抵制外界任何酸和堿對(duì)溶液ph的影響，維持ph基本不變b緩沖溶液通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成c調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同ph范圍內(nèi)使用的緩沖溶液d生物體內(nèi)的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的ph下進(jìn)行的【解析】緩沖溶液通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同ph范圍內(nèi)使用的緩沖溶液。在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液ph的影響，維持ph基本不變，超過(guò)一定范圍，緩沖溶液就起不到這樣的作用了?！敬鸢浮縜3sds聚丙烯酰胺凝膠電泳法中加入sds的作用是() 【導(dǎo)學(xué)號(hào)：05520041】a增大蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量b改變蛋白質(zhì)分子的形狀c掩蓋不同蛋白質(zhì)分子間的電荷差別d減小蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量【解析】sds是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入還原劑和sds后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和sds結(jié)合成蛋白質(zhì)sds膠束，所帶的負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，從而僅根據(jù)蛋白質(zhì)分子亞基的不同就能分離蛋白質(zhì)?！敬鸢浮縞蛋 白 質(zhì) 提 取 和 分 離 的 實(shí) 驗(yàn) 操 作1樣品處理(1)紅細(xì)胞的洗滌：目的：去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。方法：(2)血紅蛋白的釋放：目的：使紅細(xì)胞破裂釋放血紅蛋白。過(guò)程：(3)分離血紅蛋白溶液：將混合液離心將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去脂溶沉淀層于分液漏斗中靜置片刻分離出下層的紅色透明液體。2粗分離透析(1)過(guò)程：取1 ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將其放入盛有300 ml的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/l的磷酸緩沖液中(ph為7.0)，透析12 h。(2)目的：將相對(duì)分子質(zhì)量較小(填“大”或“小”)的雜質(zhì)除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。3純化凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的制作：取長(zhǎng)40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。柱底制作：打孔挖凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。柱頂制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝，并在下端出口連接帶開(kāi)關(guān)的尼龍管，尼龍管放入收集器。(2)凝膠色譜柱的裝填：色譜柱固定于支架上。干凝膠的計(jì)算和稱(chēng)量。溶脹：干凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。裝填：打開(kāi)下端出口，將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。洗滌平衡：裝填完后，立即連接洗脫瓶，用20 mmol/l的磷酸緩沖液洗滌平衡凝膠12 h。(3)樣品的加入和洗脫：調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用量為1 ml樣品滲入凝膠床：樣品完全進(jìn)入凝膠層洗脫：打開(kāi)下端出口，用磷酸緩沖液洗脫收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 ml收集一管，連續(xù)收集4純度鑒定在鑒定的方法中，使用最多的是sds聚丙烯酰胺凝膠電泳。探討：洗滌紅細(xì)胞時(shí)能否用蒸餾水代替生理鹽水？提示：不能。生理鹽水能保持紅細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)定而不至于破裂，在未洗凈血漿中的雜質(zhì)蛋白前，紅細(xì)胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。探討：在血紅蛋白釋放過(guò)程中，加入蒸餾水和甲苯的目的是什么？提示：(1)加入蒸餾水使紅細(xì)胞吸水漲破。(2)細(xì)胞膜的主要成分為磷脂，易溶于甲苯等有機(jī)溶劑，加入甲苯能加速紅細(xì)胞破裂并釋放出血紅蛋白。探討：血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？提示：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀(guān)察顏色來(lái)判斷收集洗脫液的時(shí)機(jī)。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀(guān)，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。1樣品處理、分離與純化的目的不同目的紅細(xì)胞洗滌去除雜質(zhì)，如血漿蛋白血紅蛋白釋放使紅細(xì)胞破裂，釋放血紅蛋白分離血紅蛋白溶液經(jīng)過(guò)離心使血紅蛋白與其他雜質(zhì)分離開(kāi)透析除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)純化除去相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)2.對(duì)實(shí)驗(yàn)的分析(1)對(duì)血液樣品處理后樣品發(fā)生的變化正?，F(xiàn)象：由于血紅蛋白與氧氣結(jié)合呈鮮紅色，與二氧化碳結(jié)合呈暗紅色，所以剛分離的血紅蛋白溶液呈紅色。分層不明顯的原因：洗滌次數(shù)少，未完全除去血漿蛋白。紅細(xì)胞不純凈的原因：離心速度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀而造成。(2)判斷裝填的凝膠色譜柱成功與否判斷方法：a在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填均勻。b加入大分子的有色物質(zhì)，觀(guān)察色帶移動(dòng)情況。成功的標(biāo)準(zhǔn)及調(diào)整：判斷標(biāo)準(zhǔn)：若色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明性能良好。調(diào)整方法：若色譜柱內(nèi)出現(xiàn)紋路或是氣泡，可輕輕敲打柱體以消除氣泡，若消除不了則重新裝柱。(3)對(duì)分離效果的判斷若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說(shuō)明分離效果不好，裝填不成功。1在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對(duì)樣品的處理，分析正確的是()a洗滌紅細(xì)胞的目的是除去血漿中的葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽b洗滌時(shí)離心速度過(guò)慢，時(shí)間過(guò)短，白細(xì)胞等會(huì)沉淀，達(dá)不到分離的效果c洗滌過(guò)程選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的nacl溶液d透析的目的是去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)【解析】本題主要考查了血紅蛋白提取和分離中的樣品處理。洗滌紅細(xì)胞的目的主要是除去血漿中的蛋白質(zhì)；洗滌時(shí)離心速度過(guò)快，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果；洗滌過(guò)程用到的是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的nacl溶液。故正確答案為d?！敬鸢浮縟2下列是有關(guān)血紅蛋白的提取與分離的問(wèn)題，請(qǐng)回答下列問(wèn)題。(1)人們用雞的紅細(xì)胞提取dna，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白，其原因是_。(2)凝膠色譜法是根據(jù)_分離蛋白質(zhì)的有效方法。所用的凝膠實(shí)際上是一些_。(3)蛋白質(zhì)的提取和分離實(shí)驗(yàn)中，首先要用_(填寫(xiě)溶液名稱(chēng))洗滌紅細(xì)胞，其目的是去除_。(4)在_和甲苯的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。用_法可分離出血紅蛋白。(5)取血紅蛋白溶液裝入透析袋，再將透析袋放入ph為7.0的_中，透析12 h。【解析】哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞退化，沒(méi)有細(xì)胞核和細(xì)胞器，沒(méi)有dna，血紅蛋白含量豐富；而雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有dna，可以用于提取dna。凝膠色譜法也叫做分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，使用的洗滌液是生理鹽水，要重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，不能用清水或蒸餾水洗滌，因?yàn)樯睇}水可以使紅細(xì)胞維持正常的形態(tài)。釋放出的血紅蛋白用離心的方法進(jìn)行分離。為避免破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，要用磷酸緩沖液進(jìn)行透析，以保證ph的相對(duì)穩(wěn)定。【答案】(1)雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有dna，適合用于提取dna；人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，且血紅蛋白含量豐富，適合用于提取血紅蛋白(2)相對(duì)分子質(zhì)量的大小微小的多孔球體(3)生理鹽水雜蛋白(4)蒸餾水離心(5)(磷酸)緩沖液1下列關(guān)于樣品的加入和洗脫的操作不正確的是()a加樣前，打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面b加樣后，打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)c等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口d用吸管小心地將1 ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面【解析】加樣前，打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊?！敬鸢浮縜2相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的分離過(guò)程可表示為下列哪一項(xiàng)()【解析】相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快；相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)后流出?！敬鸢浮縝3凝膠柱制作的順序一般是() 【導(dǎo)學(xué)號(hào)：05520042】橡皮塞打孔挖凹穴裝玻璃管蓋尼龍網(wǎng)蓋尼龍紗將橡皮塞插入玻璃管接尼龍管、裝螺旋夾柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞abcd【解析】凝膠柱制作的一般流程是：選擇玻璃管選擇合適的橡皮塞打孔挖凹穴蓋尼龍網(wǎng)蓋尼龍紗將橡皮塞插到玻璃管接尼龍管裝螺旋夾柱頂插入安裝玻璃管的橡皮管?！敬鸢浮縝4血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中o2或co2的運(yùn)輸。請(qǐng)根據(jù)血紅蛋白的提取和分離流程圖回答問(wèn)題。(1)將實(shí)驗(yàn)流程補(bǔ)充完整：a為_(kāi)，b為_(kāi)。凝膠色譜法是根據(jù)_而達(dá)到蛋白質(zhì)分離的有效方法。(2)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除_，洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去_；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使_一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。洗滌干凈的標(biāo)志是_。釋放血紅蛋白的過(guò)程中起作用的是_。(3)在洗脫過(guò)程中加入物質(zhì)的量濃度為20 mmol/l的磷酸緩沖液(ph為7.0)的目的是_。如果紅色區(qū)帶_，說(shuō)明色譜柱制作成功?！窘馕觥磕z色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，在蛋白質(zhì)提取與分離過(guò)程中包括樣品的處理、粗分離、純化和純度鑒定四步，每一步均應(yīng)用了不同的操作技術(shù)，需要注意?！敬鸢浮?1)血紅蛋白的釋放樣品的加入和洗脫相對(duì)分子質(zhì)量的大小(2)雜蛋白(血漿蛋白)血漿蛋白白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞離心后的上清液中沒(méi)有黃色蒸餾水和甲苯(3)準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的生理環(huán)境，保持體外的ph和體內(nèi)一致均勻一致地移動(dòng)課堂小結(jié)：網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建核心回扣1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)取決于相對(duì)分子質(zhì)量的大小，相對(duì)分子質(zhì)量大的路程較短，移動(dòng)速度快；相對(duì)分