DNA提取方法和步驟ppt.ppt

植物DNA的提取與純化DNAextraction 實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)原理 植物DNA的分離是分子生物學(xué) 遺傳學(xué)和育種學(xué)等植物科學(xué)研究的基礎(chǔ)要求 對(duì)DNA提取一般有三個(gè)要求 1 DNA的純度可以滿足下游操作的要求 2 DNA必須完整 3 DNA應(yīng)當(dāng)有足夠的量 構(gòu)建基因組文庫(kù) 初始DNA長(zhǎng)度必須在100kb以上 否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少 RFLP和PCR分析 DNA長(zhǎng)度可短至50kb 在該長(zhǎng)度以上 可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段 20kb以下 并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段 一般2kb以下 如果對(duì)植物進(jìn)行大規(guī)模篩選 操作程序應(yīng)當(dāng)快捷 簡(jiǎn)便 價(jià)格低廉 并盡可能避免使用有毒試劑 核酸的理化性質(zhì)RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶 DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物 除肌苷酸 鳥苷酸具有鮮味外 核酸和核苷酸大都呈酸味 DNA RNA和核苷酸都是極性化合物 一般都溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有機(jī)溶劑 它們的鈉鹽比游離酸易溶于水 RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g L DNA在水中為10g L 呈黏性膠體溶液 在酸性溶液中 DNA RNA易水解 在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定 天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白 DNP 形式存在于細(xì)胞核中 要從細(xì)胞中提取DNA時(shí) 先把DNP抽提出來(lái) 再把蛋白質(zhì)和糖去除 同時(shí)除去RNA及無(wú)機(jī)離子等 從中分離DNA 核酸的提取方法提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法 對(duì)它們進(jìn)行稍加修改就可以應(yīng)用于DNA的微量提取 兩種方法均采用去污劑裂解細(xì)胞并保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸內(nèi)切酶降解 具體方法簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)就是利用液氮對(duì)植物組織進(jìn)行研磨 從而破碎細(xì)胞 細(xì)胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜 使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái) EDTA抑制DNA酶的活性 再用酚 氯仿抽提的方法去除蛋白 得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 實(shí)驗(yàn)材料 新鮮植物組織 100mmol LTris HCl pH8 0 50mmol LEDTA500mmol LNaCl1 5 SDS DNA提取緩沖液 實(shí)驗(yàn)所需試劑 24 1 氯仿 戊醇其它試劑 液氮 TE緩沖液 無(wú)水乙醇 70 乙醇 2 CTABbuffer100mMTrispH8 01 4MNaCl20mMEDTApH8 02 CTAB0 2 巰基乙醇酚 氯仿 1 1 氯仿 50ml無(wú)水乙醇 實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)驗(yàn)步驟 取新鮮葉片約3g 剪碎 加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)移至2ml離心管中 2 在65 預(yù)熱的提取液中按3 8g L加入NaBisufite 混勻并調(diào)pH至8 0 3 在管中加入適量提取液 60 水浴保溫約30min 不時(shí)顛倒混勻 4 冷卻至室溫后加入等體積氯仿 異戊醇 用力搖勻后 放置搖床上搖動(dòng)15min左右 5 室溫下10000rpm離心15min 小心吸上清于新的離心管中 加入兩倍體積的冷酒精 20 放置1h或過(guò)夜 6 挑出DNA置于新的管中 挑出有困難時(shí)可以低速離心后倒去上清 加入適量70 酒精 搖動(dòng)洗滌10min 重復(fù)洗滌2 3次 7 吹干DNA 加入適量TE在65 溶解 完全溶解后離心去除雜質(zhì) 加入RNase 10mg mL 室溫處理0 5 1h 除去RNA 4 或 20 貯存 如需純化DNA 再加入適量TE 氯仿 異戊醇多次抽提后吸取上清 加入3ml LNaAc和兩倍體積的乙醇 20 放置1h或過(guò)夜 吹干沉淀后 加入適量TE 65 溶解 4 或 20 貯存 2020 3 10 8 可編輯 1 植物葉子約3g 剪碎置預(yù)冷研缽中 加入液氮充分研磨 注意不能干磨 混合球磨儀 3 60 水浴保溫30 60min 加入等體積氯仿 用力搖勻 6 再次10000rpm離心5min 將上清小心吸入新的離心管中 DNA樣品在1 Agarose膠上電泳 例圖 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 微量移液槍的使用一定要規(guī)范 吸取氯仿等有機(jī)試劑要注意不要將試劑吸入槍中 提取過(guò)程中的機(jī)械力可能使大分子D