五種電泳技術(shù)的比較.doc

精品文檔五種電泳技術(shù)的比較SDSPAGE 名詞解釋： 相對(duì)遷移率（Rf） 問(wèn)答題: 1.簡(jiǎn)述SDS-PAGE的基本原理。 2.影響SDS電泳的關(guān)鍵因素有哪些？ AGEv 名詞解釋1.遷移率2.電滲3.電泳v 問(wèn)答題1.影響電泳遷移率的因素有哪些？2.試述瓊脂糖凝膠電泳分離脂蛋白的原理。CAME1.CAME的基本原理是什么？2.CAME分離血清蛋白電泳時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？PAGE名詞解釋1.凝膠總濃度2.交聯(lián)度問(wèn)答題1.與CAME相比，PAGE有哪些特點(diǎn)。2.試比較CAME與PAGE操作的區(qū)別。3.簡(jiǎn)述不連續(xù)PAGE的原理。1.瓊脂糖凝膠電泳Agarose Gel Electrophoresisv Gel Electrophoresis ：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì)作支持體的電泳。v 特點(diǎn)（characteristic）：1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點(diǎn)在凝膠的孔中泳動(dòng)。 2. 電泳操作方法簡(jiǎn)便，電泳速度快。3. 分辨率高，重復(fù)性好，電泳圖譜清晰。4. 適用于生化，免疫等定性定量測(cè)定。（一）優(yōu)點(diǎn)（advantage)1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲。2.對(duì)蛋白質(zhì)吸附極微，故無(wú)拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來(lái)分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒 等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測(cè)定。6.有熱可逆性。（二）缺點(diǎn)(disadvantage)1.機(jī)械強(qiáng)度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細(xì)菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。4.與PAGE相比，分子篩(molecular sieve)作用小，區(qū)帶少。 應(yīng)用1. 適用于大分子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化2. 臨床生化檢驗(yàn)中常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測(cè)3. 為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標(biāo) 影響遷移的因素v the size of the moleculev conformation of the molecule v the agarose concentration of a gelv Voltage百分濃度和分辨率限制v Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 510kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.21kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer. v Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case. v Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications. 瓊脂糖凝膠分離血漿脂蛋白原理： 血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預(yù)染后，以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)，在pH8.6巴比妥緩沖液中電泳，根據(jù)各脂蛋白的組成、大小、形狀分離成不同區(qū)帶。v pH 8.6 pI ，各種脂蛋白均帶負(fù)電，電泳時(shí)由負(fù)極到正極；VLDL為圓形，受阻力小，LDL形態(tài)不規(guī)則，受阻力大，所以VLDL跑在前。加樣槽在負(fù)極，由負(fù)極到正極分別是CMLDLVLDLHDL2.醋酸纖維薄膜電泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME特點(diǎn)：低吸附作用，低電滲作用，樣本用量少，親水性1.Low sorption2.Low electroosmosis 3.Small sample4.Hydrophilic 電泳圖譜不齊點(diǎn)樣時(shí)血清點(diǎn)加不均勻薄膜局部干燥電泳時(shí)供給薄膜的液量不均勻或過(guò)少緩沖液變質(zhì)電泳時(shí)薄膜位置不正,與電流方向不平行 電泳圖譜分理不清點(diǎn)樣時(shí)血清點(diǎn)加不均勻薄膜局部干燥電泳時(shí)供給薄膜的液量不均勻或過(guò)少緩沖液變質(zhì)電泳時(shí)薄膜位置不正,與電流方向不平行 電泳速度慢 電流過(guò)低 供給薄膜的液量不足 緩沖液離子強(qiáng)度過(guò)高 薄膜中雜質(zhì) 白蛋白區(qū)帶中間部分不著色，染色不足染色時(shí)間不夠、點(diǎn)樣過(guò)多球蛋白向反方向移動(dòng)電滲現(xiàn)象，可提高緩沖液液面或加大電流量以改進(jìn)區(qū)帶一邊長(zhǎng)一邊短呈扭曲現(xiàn)象薄膜未緊壓在電泳槽的濾紙橋上，使薄膜接觸不良而增大了電阻。 區(qū)帶拖尾或區(qū)帶過(guò)于緊密緩沖液離子強(qiáng)度0.05可出現(xiàn)區(qū)帶拖尾；離子強(qiáng)度0.075可出現(xiàn)區(qū)帶過(guò)于緊密。血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis原理 CAME是以醋纖膜（CAM）作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。 將血清樣品點(diǎn)樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳時(shí)，血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點(diǎn)不同而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。加樣：用加樣器蘸取血清約5ul，垂直印在CAM粗糙面，點(diǎn)樣區(qū)距離邊緣約1.5cm，電泳時(shí)點(diǎn)樣面朝下。加上槽蓋平衡5分鐘后再通電。電壓1015V/cm膜總寬。電泳4060分鐘，泳動(dòng)距離約達(dá)3.54cm時(shí)即可斷電。由負(fù)極到正極可分為五條條帶 2 1 白蛋白3.聚丙烯酰胺凝膠電泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）單體和N，N-亞甲雙丙烯酰胺（N，N，N，N-methylene bisacrylamide，Bis）交聯(lián)劑通過(guò)自由基（ free radicals）聚合而成的一種多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 過(guò)硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium persulfate，AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（-N,N,N,N-tetramethylethylene diamine , TEMED）為加速劑。 TEMED量多少都會(huì)影響催化作用，須在堿性條件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧 升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?？梢愿鶕?jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。Acr/Bis：2040 完全透明且有彈性； 10 很脆，易碎，不透明； 100 糊狀不成形，易破碎常用的標(biāo)準(zhǔn)凝膠是指濃度為7.5%的凝膠交聯(lián)度CBis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。C=b/（a+b）100%電極槽緩沖液通常為pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液 分離原理1. 濃縮效應(yīng)1）凝膠層的不連續(xù)性 兩層凝膠T與C不同孔徑不同 濃縮膠孔徑大，分離膠孔徑小，蛋白質(zhì)在大孔徑濃縮膠中移動(dòng)，受阻力小，移動(dòng)速度快。 2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3帶負(fù)電，朝正極移動(dòng)，進(jìn)入濃縮膠（pH6.7），甘氨酸解離度（a）很小，有效遷移率（M a）很低，移動(dòng)速度較慢，稱為慢離子。HCl 是強(qiáng)電解質(zhì)，a=1，Cl-有效遷移率大，移動(dòng)速度快，稱快離子。蛋白質(zhì)（pI6.0）帶負(fù)電荷，有效遷移率介于兩者之間。 3）pH值的不連續(xù)性 為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，必須使?jié)饪s膠與分離膠之間pH值有所區(qū)別。3.分子篩效應(yīng)與電荷效應(yīng) 進(jìn)入分離膠后，Gly-成為快離子 分離膠只有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，根據(jù)各蛋白質(zhì)所帶電荷不同、分子大小不同而分離PAGE特點(diǎn)1.具有分子篩效應(yīng)，分辨率高2.樣品不易擴(kuò)散，用量少，靈敏度可達(dá)10-6g3.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團(tuán)4.凝膠不帶電荷，消除了電滲現(xiàn)象5.機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無(wú)色透明6.網(wǎng)孔可調(diào)節(jié) 4.SDSPAGE十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS,also called lauryl sulfate)是一種陰離子去污劑(anionic detergent )。 作用：破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性(denature)而改變?cè)械臉?gòu)象; 保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。原理（一）蛋白質(zhì)分子的解聚 樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小(molecular mass of polypeptides )，而電荷因素可以被忽略。1、SDS 陰離子去污劑(anionic detergent ) 變性劑(denaturant) 助溶性試劑 斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵(hydrogen bond) 分子去折疊 破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)2、強(qiáng)還原劑 巰基乙醇（-mercaptoethanal） 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(disulfide bond)斷裂。v SDS和還原劑的作用：（1）分子被解聚（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù) 電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超 過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除 了不同分子之間原有的電荷差異。去污劑的選擇無(wú)離子去污劑：Lubro W；Brij35， Tween Triton陽(yáng)離子去污劑：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC）陰離子去污劑：SDS deoxycholate電泳過(guò)程中的不正?，F(xiàn)象（1）“微笑”現(xiàn)象 指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說(shuō)明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。2）“皺眉”現(xiàn)象 由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。（3）“拖尾”現(xiàn)象 樣品溶解不佳引起。（4）“紋理”現(xiàn)象由于樣品中的不溶顆粒引起的。（5）偏斜現(xiàn)象 電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起（6）帶太寬 加樣量太多或加樣孔泄漏引起分子量測(cè)定1、相對(duì)遷移率（relative mobility ，Rf） Rf即用每個(gè)帶的遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的。 測(cè)量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。 蛋白帶遷移距離Rf= 溴酚藍(lán)遷移距離蛋白帶遷移距離 固定前的凝膠長(zhǎng)度 Rf= X 干燥后的凝膠長(zhǎng)度 溴酚藍(lán)遷移距離2、作圖 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，Rf為橫坐標(biāo)繪圖3、通過(guò)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量5.等電聚焦電泳Isoelectric Focusing Electrophoresis， IEFE 等電聚焦電泳(IEFE)是一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點(diǎn)電(PI)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。原理： 在電泳介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通電后，兩性電解質(zhì)會(huì)逐漸形成一個(gè)由正極到負(fù)極遞增的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)移動(dòng)并聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置。理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的特征化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；分子量要小以便與被分離大分子物質(zhì)分離；各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力梯度穩(wěn)定；兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多梯度平滑 ；對(duì)280nm的紫外光沒(méi)有或僅有很低的吸光度不影響測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)： n 分辨率高（可達(dá)0.01pH單位）；n 靈敏