分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告.docx

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)二 從cDNA文庫(kù)中靶片斷擴(kuò)增（4h）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。 2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理：PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)。經(jīng)典的PCR過(guò)程包括：變性（denaturing step）、退火（annealing step）和延伸（extension step）三個(gè)步驟。變性過(guò)程，即在高溫9498下，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之形成兩條單鏈ssDNA。隨后，模板DNA與引物的退火(復(fù)性)過(guò)程中，溫度降至55左右，特異序列的引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；之后，引物的延伸過(guò)程，DNA模板-引物結(jié)合物在耐熱的DNA聚合酶（如：Taq酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。PCR反應(yīng)的成分和作用：總體積：一般為25l100l （一）無(wú)Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過(guò)50mmol/L，否則會(huì)抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2+:終濃度為1.52.0mmol/L，其對(duì)應(yīng)dNTP為200mol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g2+，當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。 （三）BSA：一般用乙?；腂SA，起著減少PCR管對(duì)Taq酶的吸附作用，對(duì)Taq酶有保護(hù)作用。（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強(qiáng)酸性，其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7.07.5，一般存儲(chǔ)濃度為10mmol/L，各成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20200mol/L。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。（五）Taq酶：能耐95高溫而不失活，其最適pH值為8.38.5，最適溫度為7580，一般用72。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)，按53方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無(wú)35的外切酶活性，沒(méi)有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過(guò)高,會(huì)增加其錯(cuò)配率。用量一般為0.55個(gè)單位/100l。（六）模板：PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。（七）引物：引物濃度一般為0.10.5mol/L，濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。引物長(zhǎng)度一般1530個(gè)堿基，引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)降低特異性。其3末端一定要與模板DNA配對(duì)，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯(cuò)配也能引發(fā) 鏈的延伸）。 引物G+C約占4555%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。PCR反應(yīng)條件的選擇（影響因素）：1、溫度參數(shù)：（1）變性：模板變性完全與否是PCR成功的關(guān)鍵，一般先于94（或95）變性310min，接著94變性3060s。（2）退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5。引物長(zhǎng)度在1525bp可通過(guò)公Tm=(G+C)4+(A+T)2計(jì)算退火溫度，一般退火溫度在4060之間，時(shí)間為3045s。如果(G+C)低于50%，退火溫度應(yīng)低于55。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。3、延伸：延伸溫度應(yīng)在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般在7075。延伸時(shí)間要根據(jù) DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度確定，通常對(duì)于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。循環(huán)數(shù)：PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定，一般2030次循環(huán)數(shù)較合適，過(guò)多的循環(huán)數(shù)會(huì)增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定。PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：反應(yīng)初期產(chǎn)物以2n呈指數(shù)形式增加，至一定的循環(huán)數(shù)后，引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡，產(chǎn)物進(jìn)入一個(gè)緩慢增長(zhǎng)時(shí)期（“停滯效應(yīng)”），即“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)數(shù)與模板量、PCR擴(kuò)增效率、聚合酶種類、非特異產(chǎn)物竟?fàn)幱嘘P(guān)。PCR常見問(wèn)題一.沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物1.循環(huán)溫度：變性溫度、退火溫度2.引物設(shè)計(jì)3.DNA聚合酶活性4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份)5、DNA樣品二.非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀1.Mg2+濃度2.調(diào)整引物、模板、聚合酶的用量3.適當(dāng)減少循環(huán)數(shù)4.適當(dāng)提高退火溫度，縮短退火或延伸時(shí)間三.引物二聚體的形成1.檢查引物的序列2.提高退火溫度3.調(diào)整引物與模板濃度4.增加引物長(zhǎng)度四.假陽(yáng)性結(jié)果的預(yù)防實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）即PCR技術(shù)是美國(guó)Cetus公司人類遺傳研究所的科學(xué)家K.B.Mullis于1983年發(fā)明的一種體外擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。PCR具有很高的特異性、靈敏度，在分子生物學(xué)、基因工程研究、某些疾病的診斷以及臨床標(biāo)本中病原體檢測(cè)等方面具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值。雙鏈DNA分子在接近沸點(diǎn)的溫度下解鏈，形成兩條單鏈DNA分子（變性），與待擴(kuò)增片段兩端互補(bǔ)的寡核苷酸（引物）分別與兩條單鏈DNA分子兩側(cè)的序列特異性結(jié)合（退火、復(fù)性），在適宜的條件下，DNA聚合聚利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷酸（dNTP），在引物的引導(dǎo)下，按5-3的方向合成互補(bǔ)鏈，即引物的延伸。這種熱變性、復(fù)性、延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)。隨著循環(huán)的進(jìn)行，前一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，使產(chǎn)物的數(shù)量按2n方式增長(zhǎng)。從理論上講，經(jīng)過(guò)25-30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106-109倍。除上述典型的PCR反應(yīng)外，人們還根據(jù)各種用途設(shè)計(jì)了各種不同類型的特殊PCR。如利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR），即利用組織mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后合成第一鏈cDNA，以此為模板經(jīng)PCR合成特定目的基因；反向PCR，常規(guī)PCR允許擴(kuò)增兩條引物之間的DNA片段，而反向PCR則可以對(duì)靶DNA區(qū)域之外的兩側(cè)未知的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增；不對(duì)稱PCR使用的引物濃度不同，兩種引物濃度相差100倍，在最初的20個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物是雙鏈DNA，當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌暮?，高濃度引物引?dǎo)的PCR反應(yīng)產(chǎn)生大量單鏈DNA分子，可用于DNA的序列測(cè)定；在PCR-ELISA中，將引物用地高辛、生物素或放射性同位素標(biāo)記，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用ELISA方法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的靈敏度可提高百倍以上；采用定量PCR，即用熒光物質(zhì)標(biāo)記引物，根據(jù)反應(yīng)進(jìn)程中熒光變化情況，可以確定組織中mRNA含量，從而了解不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期組織特定基因的表達(dá)水平等。影響PCR反應(yīng)結(jié)果的因素較多，主要包括（1）模板的質(zhì)量：在制備模板DNA時(shí)通常需要使用蛋白變性劑及乙醇等有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)可直接影響PCR反應(yīng)；另外當(dāng)模板DNA分子量很高時(shí)，解鏈不易，可用限制酶消化以改善擴(kuò)增效果；從理論上說(shuō)，一個(gè)模板DNA分子即可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，模板濃度過(guò)高，PCR反應(yīng)的特異性下降，實(shí)際操作中可按1ng、0.1ng、0.01ng遞減的方式設(shè)置模板濃度對(duì)照。（2）引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：引物的長(zhǎng)度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55Tm=4(G+C)+2(A+T)。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。引物的3端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在3端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)少于5個(gè)，引物自身配對(duì)若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不能超過(guò)3個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進(jìn)行純化。引物濃度不宜偏高，濃度過(guò)高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說(shuō)來(lái)，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pmoL/L較好。（3）Mg2+濃度：PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較大，通常是1.5-4mmoL/L，必要時(shí)可調(diào)整Mg2+濃度。（4）dNTP濃度：1.25mmol/L，dNTP濃度過(guò)高，反應(yīng)的特異性下降。（5）反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)條件中最重要的是退火溫度，退火溫度低，引物容易結(jié)合到模板的靶DNA序列，但反應(yīng)的特異性下降；反之，特異性增加，但擴(kuò)增效果不佳。一些生物技術(shù)公司在合成引物時(shí)注明了Tm值，以此為依據(jù)，退火溫度比Tm值低3-5比較適宜。當(dāng)然，在實(shí)際操作時(shí)可設(shè)置梯度以確定最佳退火溫度。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饩酆厦告湻磻?yīng)（PCR）的基本原理及其影響因素，掌握PCR的基本操作過(guò)程。儀器PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、紫外檢測(cè)儀試劑1、引物：用去離子水配成10 mol /L。2、Taq聚合酶3、10PCR反應(yīng)緩沖液（加鎂離子）4、dNTPs：四種核苷酸混合物，濃度為10mM5、模板：含有R基因片段的重組cDNA的質(zhì)粒6、1%瓊脂糖凝膠7、50 TAE電泳緩沖液(1000 mL)Tris 242 g，Na2EDTA.2H2O 37.2 g， 溶于600 ml 去離子水中；加冰乙酸57.1 ml, 最后用去離子水定容至1000 mL。8、6 上樣緩沖液0.25% 溴酚藍(lán)；0.25%二甲苯睛藍(lán)，30%甘油，溶于水中，4保存?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、引物設(shè)計(jì) 2、PCR 3、瓊脂糖凝膠電泳4、PCR片斷的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)步驟1、反應(yīng)混合液的配制：在一個(gè)0.5mlPCR管中加入下列成分：正反兩種引物F/R各 2l10PCR 緩沖液10ldNTPs2lDNA模板1lTaq酶0.5lddH2O補(bǔ)至20l補(bǔ)至50l充分混勻，離心片刻，使液體沉至管底。實(shí)際操作時(shí)，先根據(jù)所需進(jìn)行的反應(yīng)數(shù)，配制反應(yīng)混合物（按上述配方，不含模板）。每組進(jìn)行3 個(gè)反應(yīng)，需配制76微升反應(yīng)混合物，則按上述配方的4倍進(jìn)行配制。然后分裝于4個(gè)PCR管中，每管19微升。其中3管每管加入1微升模板，另一管加入1微升水，作為對(duì)照。2、PCR反應(yīng)條件循環(huán)1：94，3分鐘；循環(huán)2-31：94變性45s、52退火45s、72延伸1min；共30個(gè)循環(huán)；最后72延伸10分鐘。3、反應(yīng)結(jié)束后，取5微升反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，其余置4保存?zhèn)溆?。?）用1 x TAE緩沖液配制瓊脂糖凝膠：在電子天平上準(zhǔn)確稱取瓊脂糖0.2g，倒入100 ml三角瓶，加入20 mL緩沖液。（2）微波爐上加熱40S。（3）待冷卻至60左右時(shí)，加入1L溴化乙啶，搖勻。（4）將凝膠倒入預(yù)先準(zhǔn)備好的制膠板上，插入梳子，待冷卻。（5）取5微升PCR產(chǎn)物在瓊脂糖膠上電泳：80V，20min。（6）取出凝膠，在紫外燈下觀察，記錄觀察結(jié)果。3、PCR產(chǎn)物的純化（1）向PCR產(chǎn)物中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1，v/v），混勻；（2）14 000 r/m 離心5min；（3）取上清液，再加等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1，v/v），混勻；（4）14 000 r/m離心15 min；（5）取上清液，加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2)和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，-20放置2 h或過(guò)夜。（6）4，14 000 r/m離心15 min，棄上清液；（7）沉淀用70%乙醇洗滌1次；（8）14