抗壞血酸含量測定(分光光度計(jì)法).doc

植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)李玲 主編科學(xué)出版社一、 維生素C含量的測定方法（分光光度計(jì)法）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)利用分光光度計(jì)法測定維生素C（抗壞血酸）含量的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】維生素C（抗壞血酸）具有較強(qiáng)的還原力，可以把鐵離子（Fe3+）還原成亞鐵離子（Fe2+），亞鐵離子與紅菲啰啉（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉，BP）反應(yīng)形成紅色螯合物。此化合物在波長534nm處具有強(qiáng)的吸收峰，且吸光度與反應(yīng)液中抗壞血酸含量呈正相關(guān)。因此，可用比色法來測定抗壞血酸含量?！酒鞑呐c試劑】1. 實(shí)驗(yàn)儀器與用具離心機(jī)、分光光度計(jì)、研缽、電子天平、容量瓶（50ml和100ml）、漏斗、濾紙、離心管、試管。2. 實(shí)驗(yàn)試劑50g/L三氯乙酸（TCA）溶液：稱取5g三氯乙酸（分析純），用蒸餾水溶解，稀釋至100ml。0.4%磷酸-乙醇溶液：量取0.47ml 85%磷酸溶液加入到無水乙醇中，并用無水乙醇稀釋至100ml。5g/L BP-乙醇溶液：稱取0.25g BP（純度97%）加入到無水乙醇中溶解，并用無水乙醇稀釋至50ml。0.3g/L FeCl3-乙醇溶液：稱取0.03g FeCl3加入到100ml無水乙醇中，搖勻。100g/ml 標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液：稱取10mg 抗壞血酸（應(yīng)為潔白色，如變?yōu)辄S色則不能用），用50g/L TCA 溶液溶解，定容至100ml，即1ml溶液含100g抗壞血酸?，F(xiàn)用現(xiàn)配，保存于棕色瓶中，低溫冷藏。3. 實(shí)驗(yàn)材料蘋果、梨、香蕉、柑橘等果實(shí)。【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，編號(hào)，按表1加入各種溶液，將混合液置于30反應(yīng)60min，然后以0號(hào)試管混合液為參照，于波長534nm處測定吸光度值。以抗壞血酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)匯至標(biāo)準(zhǔn)曲線，求的回歸方程。表1 制作抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑含量項(xiàng)目試管號(hào)0123456抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液/ml00.10.20.30.40.50.650g/L TCA/ml2.01.91.81.71.61.51.4無水乙醇/ml1.01.01.01.01.01.01.0混勻、搖勻0.4%磷酸-乙醇溶液/ml0.50.50.50.50.50.50.55g/L BP-乙醇溶液/ml1.01.01.01.01.01.01.00.3g/L FeCl3-乙醇溶液/ml0.50.50.50.50.50.50.5相當(dāng)于抗壞血酸量/g01020304050602. 提取洗凈新鮮果實(shí)，吸干，剪碎后混勻，分別稱取5g 樣品置于研缽中，加入20ml 50g/L TCA溶液，在冰浴條件下研磨成漿狀，轉(zhuǎn)入到100ml容量瓶中，并用50g/L TCA 溶液定容至刻度，混合、提取10min后，過濾收集濾液備用。3. 測定取1ml樣品提取液于試管中，加入1ml 50g/L TCA溶液，再按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線想通的方法，加入其他成分，進(jìn)行反應(yīng)、測定。記錄反應(yīng)體系在波長534nm處吸光度。重復(fù)3次。【實(shí)驗(yàn)作業(yè)】計(jì)算不同果實(shí)維生素C含量。VmVsM1000根據(jù)吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出響應(yīng)的混合液中抗壞血酸質(zhì)量，按下式計(jì)算植物組織中抗壞血酸含量。植物組織中抗壞血酸含量以100g樣品（鮮重）中含有的抗壞血酸的質(zhì)量表示，即mg/100g?？箟难岷? 100 （mg/100g）式中，m為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的抗壞血酸的質(zhì)量（g）；Vs為滴定時(shí)所用樣品中提取液體積（ml）；V為樣品提取液總體積（ml）；M為樣品質(zhì)量（g）。【實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展】利用此法還可以測定植物組織中脫氫抗壞血酸和總抗壞血酸的含量。測定原理：利用二流蘇糖醇（DTT）將脫氫抗壞血酸還原成還原型的抗壞血酸，這樣可以通過測定抗壞血酸的含量對(duì)脫氫抗壞血酸進(jìn)行定量分析。測定方法：取 1 ml樣品中提取液，加入0.5ml 60mmol/L DTT乙酸溶液，再用Na2HPO4-NaOH溶液調(diào)p-H至78，置于室溫下10min，使脫氫抗壞血酸還原。然后加入0.5