鎳柱蛋白純化.doc

鎳柱蛋白純化一、原理鎳柱里面含有瓊脂糖微球體，在瓊脂糖鰲合介質的作用下微球體與Ni2+發(fā)生螯合，螯合后的Ni2+能與HIS上的咪唑環(huán)發(fā)生特殊的相互作用，從而實現(xiàn)蛋白質的分離。影響蛋白質/多肽與金屬離子鰲合力大小的因素主要是蛋白質表面可結合的氨基酸（種類、數(shù)目和分布）、金屬離子的種類和密度、層析條件（pH、鹽的種類和濃度、添加劑等）二、緩沖液的配制(500ml PH=7.4)Binding buffer: PB 50ml Nacl 14.625g 20mM咪唑 1.8g （550mM）Washing buffer: PB 50 mM Nacl 14.625g 5mM 0.45g 10 mM 0.9g 15 mM 1.35g 20 mM 1.8g 40Mm 3.6gElution buffer: PB 50ml Nacl 14.625g 100 mM 9g 200mM 18g400mM咪唑 45g 600mM咪唑 63g三、操作步驟 此步驟過鎳柱的所有溶液、上清蛋白都要先用濾膜過濾，所有液體過鎳柱的速度要嚴格控制2.5ml /min，中間鎳柱不能進氣泡1、5倍鎳柱體積去離子水洗滌，去除空氣和20%乙醇 (5ml /min)2、510倍鎳柱體積Binding buffer平衡3、上蛋白樣品4、5倍鎳柱體積Wsahing buffer 洗脫雜蛋白(HIS標簽含有6個組氨酸，結合能力強于含有單個組氨酸的雜蛋白)，此步驟設洗脫梯度5、5倍鎳柱體積Elution buffer洗脫目的蛋白，此步驟設洗脫梯度6、5倍體積去離子水清洗掉緩沖液7、20%乙醇保存于 4注意：洗脫可能會把金屬離子和蛋白質的復合物一起洗下來四、鎳柱重生（介質使用約3-20次，具體與原料來源、樣品體積等有關）1. 鎳柱用去離子水清洗2. 5倍鎳柱體積EDTA 重生鎳柱(20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA，pH 7.4)3. 5倍體積 Binding buffer 平衡4. 5倍體積去離子水清洗5. 20倍體積 1M NaoH 洗滌6. 水洗至中性7. 5倍柱體積掛鎳8. 用5倍體積以上的純水清洗層析柱，去除游離的金屬離子9. 20% 乙醇保存 4五、注意事項1、推薦在中性至弱堿性的條件下（PH 78）結合重組蛋白，磷酸鹽Buffer是常用的緩沖液，Tric-cl在一般情況下可用，但要注意它會降低結合強度2、避免在Buffer中包含EDTA或檸檬酸鹽等螯合劑3、若重組蛋白以包涵體形式表達，在所有Buffer中添加6M鹽酸胍或8M尿素4、避免緩沖液中有高濃度的供電子基團，如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris5、各種Buffer中不能含有高濃度的強還原劑，比如DTT，防止二價NI被還原6、不能含有離子型的去垢劑，比如SDS,防止Ni流失7、Buffer里可加入甘油，防止蛋白之間由于疏