細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù),細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念,傳代： 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。 原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。,細(xì)胞培養(yǎng)：使用單個細(xì)胞懸液組織培養(yǎng)：使用組織塊（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個器宮,原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿,原代培養(yǎng)期傳代期衰退期,有限細(xì)胞系，無限細(xì)胞系 細(xì)胞系 cell line細(xì)胞株 cell strain,培養(yǎng)細(xì)胞的特性,培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式貼附生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細(xì)胞懸浮生長： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞,每代貼附生長細(xì)胞的生長過程,游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）,游離期： 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 10分鐘一4小時,貼壁期： 細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等 血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）,潛伏期 此時細(xì)胞有生長話動，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為624小時。,對數(shù)生長期： 細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。,停止期（平臺期）： 細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性,培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件,1 細(xì)胞的營養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3 無污染 4 無毒,實驗準(zhǔn)備,實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管,壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒 濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒,超凈臺,超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。,濾 器,CO2培養(yǎng)箱,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。,自動雙重純水蒸餾器 純水儀,酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器,培 養(yǎng) 板,培養(yǎng)瓶,常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干,清潔液的配制,2 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,消化液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染,合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子； 激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分,一般說來含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長一般需加 10血清對于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子 等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。,向無清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長的補(bǔ)加物都是獨特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。 無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清,血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌,抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定,完全培養(yǎng)基的組成,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95血清 5一20碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100卑位毫升,培養(yǎng)基的配制,RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清（終濃度 10）,細(xì)胞傳代方法,根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種。 1懸浮生長細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。 2 半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。 3貼壁生長細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,貼壁生長細(xì)胞傳代方法：,1 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5 吸取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。6 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。7 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,細(xì)胞計數(shù),血細(xì)胞計數(shù)器：手工計數(shù)細(xì)胞Coulter計數(shù)儀：人工計數(shù),培養(yǎng)細(xì)胞活力測定,細(xì)胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。1 細(xì)胞克隆形成率實驗 單個細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆。克隆形成卒用來表示細(xì)胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)缺點：操作繁瑣優(yōu)點：精確、可靠,2臺盼藍(lán)法,活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力 已淘汰,3 四唑鹽（MTT）比色法,四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)， 四吐鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值 MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。,操作步驟 （1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間） （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。 （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 （4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長570納米）。記錄結(jié)果，繪制,操作步驟 （1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間） （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時。 （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 （4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長為570 nm）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線,細(xì)胞凍存和復(fù)蘇,細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。,凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融,當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。,慢凍程序,標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時，可迅速放入液氮中 細(xì)胞凍存器簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。,低溫保護(hù)劑的應(yīng)用,在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。,細(xì)胞凍存方法,1預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基 10%