大規(guī)模培養(yǎng)細胞技術.doc

大規(guī)模培養(yǎng)細胞技術摘要： 細胞培養(yǎng)工作始于20世紀初，現(xiàn)已廣泛應用于生物學、醫(yī)學各個領域，成為細胞與組織研究的重要技術之一。近年來，隨著基因工程和細胞工程技術的不斷發(fā)展，動物細胞培養(yǎng)已成為大規(guī)模生產一系列有商品價值的生物制品的重要宿主，當前人們已經(jīng)能夠生產多種單克隆抗體、激素、細胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效應細胞等。但是，實驗室采用的細胞培養(yǎng)技術獲得的細胞量有限，不能滿足生產的需求，必修改用超產培養(yǎng)技術方法方可獲得大量細胞，目前這種技術種類繁多，歸納起來有三大類：貼壁培養(yǎng)法；懸浮培養(yǎng)法；固定化培養(yǎng)法。細胞體外培養(yǎng)技術的不斷發(fā)展和完善，為組織和器官培養(yǎng)以及現(xiàn)代生物技術前沿的轉基因動物技術、克隆技術、干細胞定向分化、體外受精、性別控制等一系列技術的發(fā)展奠定了基礎。關鍵詞：細胞培養(yǎng)；貼壁；懸??；固定化前言動物細胞培養(yǎng)開始于本世紀初1962年，動物細胞培養(yǎng)規(guī)模開始擴大，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學研究和應用中廣泛采用的技術方法，利用動物細胞培養(yǎng)生產具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，動物細胞培養(yǎng)已成為醫(yī)藥生物高技術產業(yè)的重要部分。利用動物細胞培養(yǎng)技術生產的生物制品已占世界生物高技術產品市場份額的50%。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術是生物技術制藥中非常重要的環(huán)節(jié)。本文對細胞的培養(yǎng)工藝做一綜述。1.細胞培養(yǎng)的定義細胞培養(yǎng)是指從體內組織取出細胞模擬體內環(huán)境，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養(yǎng)技術。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個細胞或細胞群。在醫(yī)學遺傳學研究中應用最廣泛的是外周血淋巴細胞、皮膚成纖維細胞和各種能在體外長期生長的細胞系。外周血淋巴細胞培養(yǎng)具有時間短、技術簡便、可重復取材等優(yōu)點，它在臨床染色體分析中使用最廣泛。體外培養(yǎng)細胞株可在培養(yǎng)過程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉化，成為永久細胞系，也可直接建成永久細胞系，永久細胞系能在體外無限制制的傳代和生長。永久細胞系通常具有非整倍體細胞和各個細胞的核型不完全相同特征。但細胞克隆的細胞系其這一特征可以不明顯。2.動物細胞培養(yǎng)的工藝2.1貼壁培養(yǎng)法貼壁培養(yǎng)是指細胞貼附在一定的固相表面進行單層培養(yǎng)。貼壁依賴性細胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)容器的壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細胞單層。貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)主要有滾瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等，其中尤以滾瓶培養(yǎng)和微載體生物反應器培養(yǎng)更為多見。2.1.1滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴性細胞最初采用滾瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。滾瓶培養(yǎng)的優(yōu)勢在于能增加供細胞貼壁的表面積，同時溫和的滾動有利于細胞生長。細胞接種在滾動的圓筒形滾瓶中，培養(yǎng)過程中滾瓶不斷滾動，在培養(yǎng)瓶滾動時，細胞有一段時間離開培養(yǎng)基，使細胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，增加了氣體的交換，有利于細胞生長。滾瓶培養(yǎng)具有結構簡單，投資少，技術成熟，重復性好，放大只需要簡單的增加滾瓶數(shù)量等優(yōu)點。但滾瓶培養(yǎng)也有其缺點，勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。2.1.2微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體培養(yǎng)技術于1967年被用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)1。經(jīng)過30余年的發(fā)展，該技術目前已日趨完善和成熟，并廣泛應用于生產病毒疫苗和重要蛋白質產品等。微載體培養(yǎng)原理是將對細胞無害的微載體顆粒加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，但動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，所以無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作方式是在貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停，數(shù)小時后，待細胞附著于微載體表面后，維持低轉速（最大速度75r/min），進入培養(yǎng)階段。我國從20世紀80年代后期開始了細胞培養(yǎng)專用介質的研究工作，成功地開發(fā)了CT-1、CT-2和CT-3等適合于不同細胞系培養(yǎng)的微載體2,3。微載體法培養(yǎng)動物細胞有很多好處1：可在反應器中提供大的比表面積；兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點；可采用均勻懸浮培養(yǎng)；可用普通顯微鏡觀察細胞在微載體上的生長情況；放大容易；適用于多種貼壁依賴性細胞培養(yǎng)；細胞收獲容易；勞動強度小，占地面積小。微載體系統(tǒng)也有它的缺陷：細胞生長在微載體表面，易受到剪切損傷；微載體價格比較貴；需要較高的接種細胞量。近年來，已經(jīng)開發(fā)了許多新的多孔性微載體和新的反應器系統(tǒng)，以彌補微載體系統(tǒng)的不足。張孝兵等4,5以明膠為原料，用懸浮成球、甲苯制孔的方法制備了大孔明膠微載體。目前國外相繼研制了數(shù)種適合進行微載體大規(guī)模細胞培養(yǎng)的生物反應器系統(tǒng)和培養(yǎng)模式，如攪拌式生物反應器系統(tǒng)、旋轉式生物反應器系統(tǒng)和灌注式生物反應器培養(yǎng)模式等。（1）攪拌式生物反應器系統(tǒng) 該系統(tǒng)已有較長的歷史，具備簡單、實用及價格低廉等特點。Werner等6成功地在該系統(tǒng)內進行了肝細胞大規(guī)模擴增的研究。（2）旋轉生物反應器（RCCS） RCCS既可以用于微載體大規(guī)模細胞培養(yǎng)，又能在其中培育細胞與支架形成的三維空間復合體。至今，近百種的組織細胞均在該系統(tǒng)內進行了大規(guī)模擴增7。 （3）灌注式生物反應器培養(yǎng)模式 其特點是在細胞培養(yǎng)生物反應器系統(tǒng)中安裝細胞/微載體截流裝置，培養(yǎng)中不斷加入新鮮培養(yǎng)基以及不斷地抽走含細胞代謝廢物的培養(yǎng)基，使細胞得以在一個相對穩(wěn)定的生長環(huán)境內增殖，既省時省力，又減少了細胞發(fā)生污染的機會，可以提高細胞密度在10倍以上8。在生物反應器中用微載體大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細胞時，細胞經(jīng)消化進行傳代，操作很復雜?，F(xiàn)在已有不經(jīng)消化直接進行微載體間細胞轉移的成功報道，通常稱為“球轉球”。張立等9用球轉球方法，以5LCelliGen細胞培養(yǎng)用生物反應器作法，在國產50LCellCul-50A細胞培養(yǎng)反應器中培養(yǎng)Vero細胞，通過換液和灌注的方法，培養(yǎng)8天，細胞密度達1.2107個/ml，然后接種狂犬病毒，連續(xù)培養(yǎng)10天，病毒滴度超過國家標準。另外，用這種球轉球方法，放大培養(yǎng)雞胚細胞生產法氏囊病毒液獲得了成功10。2.1.3巨載體培養(yǎng)巨載體培養(yǎng)，是相對微載體和細胞而言的。在這種培養(yǎng)方式中，細胞雖然也像微載體一樣貼附于固定的表面生長，但巨載體在生物反應器中是固定的，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起運動。2.2懸浮培養(yǎng)細胞懸浮培養(yǎng)是指在反應器中自有懸浮生長的過程。懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)主要用于非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。雜交瘤細胞的懸浮培養(yǎng)是研究得最廣泛和透徹的動物細胞培養(yǎng)過程，培養(yǎng)規(guī)模最大，操作最成熟。近年來，隨著無血清培養(yǎng)技術的發(fā)展，越來越多的貼壁依賴性細胞被馴化適合于無血清懸浮培養(yǎng)，例如重組CHO細胞和BHK細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)都獲得了成功11。2.3固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)是將動物細胞與水不溶性載體結合起來，再進行培養(yǎng)的方法。細胞固定化的制備方法很多包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯(lián)法、包埋法、微載體法、自絮凝發(fā)等。（1）吸附法 用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法。（2）共價貼附法 利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法。（3）離子/共價交聯(lián)法 雙功能試劑處理細胞懸浮液，在細胞間形成橋而絮結產生交聯(lián)作用的方法。（4）包埋法 將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞的方法。（5）微載體法12 用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質及營養(yǎng)物質可自由出入半透膜的方法。（6）自絮凝發(fā)13 許多哺乳動物細胞系，特別是在無血清培養(yǎng)下，具有相互聚集、形成細胞團的傾向。利用細胞的這一特性，可以采用沉降或過濾的手段，是細胞團截流在攪拌培養(yǎng)系統(tǒng)中，起到類似于微載體和多孔微載體的作用，結合細胞培養(yǎng)過程的檢測成，提高機體對礦物質和微量元素的利用率 產生消化酶提高營養(yǎng)物質的利用率。和控制，實現(xiàn)細胞高密度長期培養(yǎng)和產物高效生產的方法。3.發(fā)展前景現(xiàn)利用細胞培養(yǎng)技術已經(jīng)可以產出多種生物制品，如：狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗，表皮生長因子等生長因子，激素、干擾素、白細胞介素等生物調節(jié)劑，單克隆抗體及酶制劑等。細胞的大規(guī)模培養(yǎng)已成為必然趨勢，大規(guī)模生產細胞技術將的到廣泛應用。參考文獻1 李雨田,陳因良,丁健椿.細胞培養(yǎng)專用微載體M.北京:化學工業(yè)出版社,1993:12202 張書元,徐殿勝,王國政.用于培養(yǎng)動物細胞微載體的制備J.華東化工學院學報,1989,15:143 陳因良,李雨田,張書元,等.小牛皮提取的膠原-微載體用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)J.生物工程學報,1992,8:1571634 趙孝兵,張元興,李雨田.大孔明膠微載體的制備J.華東理工大學學報,1997,23:412416,4215 趙孝兵,張元興.用大孔明膠微載體培養(yǎng)Vero細胞J. 華東理工大學學報,1997,23:4174216 Werner A,Duvar S,Muthing J.Cultivation of immortalized human hepatocytes HepZ on macroporous CultiSpher GmicrocarriersJ.Biotechnol 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目：牛痘病毒疫苗的過去、現(xiàn)在和未來牛痘病毒疫苗的過去、現(xiàn)在和未來摘要：牛痘病毒疫苗一度比其他人用疫苗更為廣泛的用于人類的疫病免疫。近兩個世紀以來，牛痘病毒疫苗被大量使用，為人們抵抗天花的感染提供交叉保護，直到上世紀70年代天花被人類徹底消滅。即使天花已經(jīng)被完全消滅，但人們仍繼續(xù)對牛痘病毒疫苗進行不間斷的研究，并研制出許多具有更高安全性的改良疫苗。通過在非易感宿主體內連續(xù)傳代、敲除病毒的毒力基因，或者增強病毒保護性抗原的表達等策略，疫苗的毒性已經(jīng)得到進一步的降低。高度減毒的第三或第四代的牛痘病毒疫苗現(xiàn)今仍被大量儲備，以防備可能被用于生物恐怖武器的天花病毒?？蒲腥藛T現(xiàn)在也常常將牛痘病毒的基因組作為一個有力的基因工具，用來生產多種新型的基因載體疫苗，例如一種用于野生動物狂犬病的口服疫苗，其關鍵的糖蛋白基因即是由重組的牛痘病毒所攜帶并有效表達。關鍵詞：痘病毒；痘；天花；牛痘病毒；疫苗載體 導言 200年前，愛德華詹納第一次引種牛痘病毒抵御天花病毒，這是人們歷史上唯一一次非常成功的公眾健康干預事例。這種方法起源于英國格洛斯特郡，在農場周圍被廣泛使用，最終在70年代末引起一場全球性消滅天花的運動的發(fā)生。雖然自然感染的天花病毒已由于人們的免疫接種而被消滅，但人們對牛痘病毒以及天花病毒牛痘疫苗的興趣并沒有消失。在過去的三十年中，研究人員通過各種實驗室手段，發(fā)現(xiàn)并獲得一株高度減毒的、安全性能明顯提高的新型病毒。與此同時，牛痘基因組因其高度的復制能力和載體功能，被病毒學家視為生產多種病原微生物疫苗的首選。1.正痘病毒抗原交叉反應和推廣戰(zhàn)略痘病毒分為8個屬。其中人們最感興趣的正痘病毒屬包括：天花病毒，即痘病毒的代表性病毒；牛痘病毒，即詹納最先使用的疫苗；疫苗毒，在19世紀的某些期已取代牛痘病毒成為首選的免疫制品。由于正痘病毒屬病毒蛋白結構天然具有高度的保守性，因此由VACV可為其它多種正痘病毒例如猴痘病毒的感染，提供交叉保護。痘病毒具有大型的基因組（130,000-375,000個核苷酸），因其允許插入和表達外來的大型基因，使得它們成為理想的基因工程苗載體。痘病毒復制周期中的許多特點都將影響其作為疫苗在使用中的功效。復制起始階段，病毒核芯進入細胞，早期基因轉錄的結果將產出一系列免疫調節(jié)蛋白，可封阻機體抗病毒反應程序的啟動，包括IFN的作用。經(jīng)過現(xiàn)代研究表明，敲除或修改這些病毒基因是修改病毒疫苗毒力的一種非常有效的手段。在其后的復制周期中，具有傳染性的病毒粒子即可產生具有牛痘疫苗效果的病毒蛋白，并在病毒粒子成熟后從病毒的囊膜表面釋放出來。通過基因敲除技術，改變病毒囊膜表面的特定蛋白（如B5R）也可以減弱病毒疫苗的毒力。2.全球消滅天花運動前牛痘苗的發(fā)展在人類對抗天花歷史上，1000年前已有人進行人痘接種(Radetsky,1999)。人們從天花病人的膿胞液中獲取天花病毒，經(jīng)吹入法或劃痕法給人群接種，這種方法雖會引起嚴重的局部反應、周身皮疹和全身癥狀，但它將由感染天花而導致的人群死亡率由20-30%降至0.5-2%。盡管并發(fā)癥的發(fā)生幾率比較高，但人痘接種還是被普遍的應用，直至19世紀初期。因為痘病毒屬成員的抗原都具有較高的同源性，所以經(jīng)免疫后，人類幾乎可以抵抗任何痘病毒屬病毒的攻擊。17世紀后期，愛德華詹納發(fā)現(xiàn)牛痘可以幫助人們預防天花。自從人們發(fā)現(xiàn)牛痘接種比人痘接種要安全以后，牛痘接種很快成為了最主要的免疫手段。隨著時間的流逝，牛痘病毒疫苗已經(jīng)取代了人痘疫苗成為免疫的主要制劑。眾所周知，牛痘病毒疫苗在遺傳上與人痘病毒和天花病毒皆有所不同，雖然它與馬痘極其相近，但它的起源我們無從得知。詹納的牛痘病毒是第一代痘病毒的代表。3.第一代牛痘疫苗和全球消滅天花運動人類是唯一一個已知的天花病毒的自然宿主。正是由于這個原因以及牛痘疫苗的確切功效，使得人們在1966年加緊了全球消滅天花計劃。這項計劃的基本策略是在每個地區(qū)建立監(jiān)測系統(tǒng)，防止暴發(fā)流行。由于這些措施的有效實施，天花的發(fā)病率逐年降低，最后一個自然感染的天花病例出現(xiàn)在1977年的索馬里。1980年5月，世界衛(wèi)生大會發(fā)表聲明，世界將不會再有自然發(fā)病的天花病人（Rotz.等人,2001; Wehrle，1980）。1982年，在美國唯一一家允許生產牛痘疫苗的廠家停止生產一般用牛痘疫苗，1983年普通人群也停止了疫苗的使用。在消滅天花病毒計劃實施期間，這些疫苗的大多數(shù)是在活的綿羊、水牛及兔子的皮膚上生產的(Anon.,2002)。在消滅天花計劃過程中應用了許多病毒毒株。美洲和非洲西部用的是紐約市衛(wèi)生局的毒株（NYCBH）。這個計劃的相關研究一直在惠氏公司的實驗室進行，并持續(xù)到2007年8月前。Dryvax是唯一在美國可以有限制使用的商品化牛痘苗(Rosenthal et al.,2001)。Dryvax牛痘苗是以NYCBH為生產毒株，感染小牛