生理學實驗報告-蛙心灌流 (2).doc

蛙類離體心臟灌流一、【目的要求】1、學習離體蛙心灌流法。2、觀察Na+,K+,Ca2+及腎上腺素(Adr),乙酰膽堿(ACh),乳酸對離體心臟活動的影響。二、【原理】將離體蛙心（失去神經(jīng)支配的蛙心）保持在適宜的環(huán)境中，在一定的時間內仍然能夠保持節(jié)律性收縮，心臟正常的節(jié)律性活動需要一個適宜的理化環(huán)境，離體心臟也是如此，離體心臟脫離了機體的神經(jīng)支配和全身體液因素的直接影響，可以通過改變灌流液的某些成分，觀察其對心臟活動的作用。心肌細胞的自律性、興奮性、傳導性及收縮性，都與鈉、鉀及鈣等離子有關。外源性給予去甲腎上腺素或乙酰膽堿可產(chǎn)生類似心交感神經(jīng)或迷走神經(jīng)興奮時對心臟的作用。3、 【實驗儀器】青蛙、 常用手術器械、蛙板(或蠟盤)、蛙心夾、計算機采集系統(tǒng)、張力傳感器、支架、雙凹夾、雙針形露絲刺激電極、滴管、培養(yǎng)皿(或小燒杯)、棉線、任氏液。套管夾、065NaCl、2CaCl2、1KCl、1：10000腎上腺素、1：10000乙酰肌堿、3%乳酸。4、 【方法與步驟】1、斯氏蛙心插管法（1）一只青蛙，雙毀髓后背位置于蠟盤中，按前面的方法暴露心臟。仔細識別心臟周圍的大血管(見右圖)。在左主動脈下方穿一線，于動脈圓錐處結扎(動物個體小時，結扎位置可靠上些)。再從左右兩主動脈下方穿一線，并打一活結備用。左手提起主動脈上的結扎線，右手用眼科剪在結扎線下方、沿向心方向將動脈上壁剪一斜口。選擇大小適宜的蛙心套管，然后將盛有少量(套管內23 cm高度)任氏液(內加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管，山開口處插入動脈圓錐(見右圖)。當套管尖端到達動脈圓錐基部時，應將套管稍稍后退，使尖端向動脈圓錐的背部后下方及心尖方向推進，經(jīng)主動脈瓣插入心室腔內(于心室收縮時插入，但不可插得過深，以免心室壁堵住套管下口)。此時可見套管中血液沖人套管，并使液面隨心臟搏動而亡下移動，表明操作成功(否則需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液，更換新鮮任氏液。穩(wěn)定住套管后，輕輕提起備用線，將左、右主動脈連同插入的套管用雙結扎緊(不得漏液)，再將結線固定在套管的小玻璃鉤上，然后剪斷結扎線上方的血管。輕輕提起套管和心臟，看清靜脈竇的位置，于靜脈竇下方剪斷有牽連的組織，僅保留靜脈竇與心臟的聯(lián)系，使心臟離體(切勿損傷靜脈竇)。用任氏液反復沖洗心室內余血，使套管內灌流液不再有殘留血液。保持套管內液面高度一致(1.52 cm)，即可進行實驗。（2）將插好離體心臟的套管固定在支架上，用蛙心夾夾住少許心尖部肌肉 (不可夾得過多，以免因夾破心室而漏液)。再將蛙心夾上的系線繞過一個滑輪與張力傳感器相連（如右圖）。注意：勿使灌流液滴到傳感器上。調節(jié)顯示器上心臟收縮曲線的幅度適中。2、 實驗觀察(1)記錄正常心搏曲線(2)改用065NaCI溶液灌流，并作好加藥標記，觀察心搏變化。待曲線 氏插管裝置出現(xiàn)明顯變化時，立即吸去套管中的灌流液，同時做好沖洗標記，并用新鮮任氏液清洗23次，待心搏恢復正常。注意：換液時切勿碰套管，以免影響描記曲線的基線，同時保持灌流液面一致(以下同)。觀察可得，NaCI溶液會阻遏心臟搏動。(3) 迅速用新鮮任氏液清洗23次，待心搏恢復正常。向套管內加入13滴2CaCI：溶液，觀察并記錄心搏曲線的變化。當出現(xiàn)明顯變化時，立即更換任氏液，待心搏恢復正常(如果恢復遲緩，可多次沖洗)。(4)同法向套管中加12滴1KCl溶液，記錄心搏曲線的變化。當心搏曲線變化時，同法更換灌流液，待心搏恢復正常。(5)同法記錄套管中加入l2滴的腎上腺素溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。(6)同法記錄套管中加入12滴乙酰膽堿溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。（7）同法記錄套管中加入l2滴的3%乳酸后心搏曲線的變化。5、 【實驗結果與原因分析】曲線的幅度收縮的程度曲線的密度心率曲線的基線舒張的程度1、正常收縮曲線圖2、滴加0.65%NaCl溶液圖分析：滴加0.65%NaCl溶液后，心跳減弱，這是由于用0.65%NaCl溶液灌注蛙心時，由于灌注液中缺乏Ca2+（），以致心肌細胞動作電位2期內流Ca2+減少，細胞質Ca2+濃度減少，心肌的收縮活動也隨之減弱。3、 滴加2%CaCl溶液分析：細胞外Ca2在細胞膜上對Na內流有競爭性抑制作用，稱為膜屏障作用。Ca2 0增高時，Na內流受抑制，細胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導性均降低。Ca2 0增高使Ca2內流增多，因此慢反應細胞0期去極化加快加強，傳導性增高，而快反應細胞平臺期縮短，有效不應期縮短，復極加速。Ca2內流增多，使心肌收縮能力增強。Ca2 0降低時，所引起的變化與高鈣時相反。因此加入CaCl2后，心率減少、振幅減少，基線上移。4、 滴加1%KCl溶液分析：滴加1后的心搏曲線發(fā)現(xiàn)，曲線的頻率逐漸減小，愈來愈疏，幅度逐漸下降，最后停止在基線處，即心臟停博于舒張狀態(tài)。因為當細胞K+濃度增高時，K+與Ca2+有競爭性拮抗作用，K+抑制細胞膜對Ca2+的轉運，使進入細胞內Ca2+減少，心肌的興奮收縮偶聯(lián)過程減弱，心肌收縮力降低。所以心搏曲線振幅減小。5、 滴加1：10000腎上腺素溶液分析：滴加腎上腺素后，蛙心收縮增強，心臟舒張完全，描記的心搏曲線幅度明顯增大。其作用機理是，腎上腺素可與心肌細胞膜上的B受體結合，提高心肌細胞和肌漿網(wǎng)膜Ca2+通透性，導致肌漿中Ca2+濃度增高，使心肌收縮增強。另外，腎上腺素還有降低肌鈣蛋白與Ca2+親和力，促使肌鈣蛋白對Ca2+的釋放速率增加，提高肌漿網(wǎng)膜攝取Ca2+的速度，刺激Na+與Ca2+交換，使復極期向細胞外排出Ca2+的作用加速，這樣，將使心肌舒張速度增快，整個舒張過程明顯增強。6、 滴加1：10000乙酰膽堿溶液分析：上圖可示，蛙心收縮減弱，心率減慢，最后出現(xiàn)蛙心停止舒張階段。其機理為：乙酰膽堿與心肌細胞膜M受體結合，一方面提高心肌細胞膜K+通道的通透性，促使K+外流，將引起：1）竇房強細胞復極時K+外流增多，最大復極電位絕對值增大；Ik衰減過程減弱，自動除極速度減慢。這兩方面因素導致竇房自律性降低，心率減慢。2）復極過程中K+外流增加，動作電位2、3期縮短，Ca2+進入細胞內減少，使心肌收縮減弱；另一方面乙酰膽堿可直接抑制Ca2+通道，減少Ca2+內流，進而使心肌收縮減弱。 7、 滴加3%乳酸溶液分析：H+與Ca2+的競爭機制，導致心肌細胞動作電位2期內流Ca2+減少，細胞質Ca2+濃度減少，心肌的收縮活動也隨之減弱。6、 【注意事項】1. 制備蛙心標本時，勿傷及靜脈竇。 2. 上述各實驗項目，一旦出現(xiàn)作用應立即用正常任氏液換洗，以免心肌受損，而且必須待心搏恢復正常后方能進行下一步實驗。 3. 盡量選用健壯、體大的雄性蟾蜍，手術過程中注意保護心臟，避免損傷。4. 實驗中及時用任氏液沖洗心臟，待曲線恢復平穩(wěn)后再進行下一步操作。5. 每次更換任氏液都必須保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量變化而影響結果。6. 嚴格控制每次藥品加入量，先加一滴，效果不明顯再加一滴。7. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管內溶液的吸管應區(qū)分專用，不可混淆使用，以免影響實驗結果。七、【討論】1. 離體蛙心制備好后，有時候館內的液面上下移動很不明顯，是何原因？如何處理？答：離體蛙心制備好后，蛙心插管內的液體應隨蛙心室的收縮和舒張活動而上下移動。其實質是：在心室收縮時，心室容積減少，室內壓升高，將心室內的液體壓入插管內，管內液面上升；在心室舒張的時候，心室容積增大，心室內壓減少，將插管內液體吸入心室，管內液面下降。但是有時候蛙心插管內液面波動不明顯，其主要原因是： 插管內尖端出現(xiàn)血凝塊。 插管尖端不在心室腔內，而是在心房或者脈間結締組織等地方。 插管進入心室腔內過深，以致尖端抵住了心室壁。 蛙心由于長期心肌失血，導致活力下降。2. 實驗過程中，為什么必須保持蛙心插管內液面高度的恒定？液面過高或過低會產(chǎn)生怎樣的影響？答：在實驗過程中，蛙心插管內液面高度發(fā)生變化，心臟收縮曲線會相應發(fā)生變化。心肌縮短幅度和速度受到前負荷和后負荷的影響。插管液面高度所產(chǎn)生的壓力，在心室舒張期末期相當于心肌的前負荷，心室開始收縮的時候，此液體所產(chǎn)生的壓力又成為心肌收縮時的后負荷。故高度的改變，進而引起的前后負荷的改變將改變心肌收縮的幅度和頻率。當液面過高時。心縮曲線幅度將降低。因為過高的液面，將使心室前負荷超過了最適前負荷，將導致粗細肌絲過于疏遠，而導致收縮的潛力減少，心肌收縮不再增加或下降。而類似的，過高的后負荷，也使心肌收縮的幅度和速度大大下降。而當液面過低時，心室收縮的幅度也會減少。因為前負荷過小，將導致粗細肌絲過于接近，而導致收縮的潛力減少，實際上，此時由于前負荷的減少導致心室收縮的效力的減少比前負荷增加而導致的還有明顯。類似的，后負荷相應的減少也會導致心室收縮的減弱。所以，在實驗中保持最適的液面高度。是取得較好實驗結果的前提。3 各種離子成分改變蛙心收縮的原理是什么？答：由于心肌細胞生物電活動和收縮過程與離子密切相關，因此，細胞外液中離子濃度升高或降低均會影響到心肌的電生理特性和收縮性。（1） 鉀離子的影響 K與靜息電位的形成有關。細胞外液K濃度K0變化對心肌生理特性的影響較為復雜。高鉀：K0輕度或中度增高時，膜內、外K濃度差減小，靜息電位絕對值減小，與閾電位差距縮短，因此，興奮性增高。 K0顯著升高時，由于靜息電位絕對值減小過多（膜內達-55mV左右），Na通道失活，因而興奮性降低甚至消失。另外，還使0期去極化速度和幅度減小，傳導性降低，導致興奮傳導減慢，甚至傳導阻滯。此外， K0增高還可提高膜對K的通透性，加速K外流，動作電位平臺期縮短，因此，不應期縮短。此外由于平臺期縮短，減少了Ca2的內流，加上細胞外K與Ca2在膜上有競爭性抑制作用，導致心肌收縮功能減弱；（2） 鈣離子的影響 細胞外Ca2在細胞膜上對Na內流有競爭性抑制作用，稱為膜屏障作用。Ca2 0增高時，Na內流受抑制，細胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導性均降低。Ca2 0增高使Ca2內流增多，因此慢反應細胞0期去極化加快加強，傳導性增高，而快反應細胞平臺期縮短，有效不應期縮短，復極加速。Ca2內流增多，使心肌收縮能力增強。Ca2 0降低時，所引起的變化與高鈣時相反。（3） 鈉離子的影響 細胞外液中鈉濃度差梯度的變化一般對心肌活動影響不明顯。只有當Na 0明顯