【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）豬肺組織中差異表達(dá)基因的篩選動(dòng)物遺傳育種碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 豬肺組織中差異表達(dá)基因的篩選 of of in of of in 要 目前，豬呼吸系統(tǒng)疾病已成為我國許多規(guī)?；i場(chǎng)和農(nóng)村養(yǎng)豬大戶十分關(guān)注的問題 。豬的呼吸道疾病被認(rèn)為是困擾豬場(chǎng)生產(chǎn)經(jīng)營的主要問題之一 ，是造成最大經(jīng)濟(jì)損失的疾病， 將是今后養(yǎng)豬業(yè)面臨的主要難題。 豬呼吸 系統(tǒng) 疾病是多種因素綜合作用的結(jié)果， 除了 遺傳因素 以外，還 包括傳染性、環(huán)境 以及 管理 因素 等 。 豬呼吸 系統(tǒng) 疾病 的肺組織炎癥過程常導(dǎo)致 肺間質(zhì)纖維化 ， 是呼吸衰竭的重要原因。 通過遺傳選擇提高肺組織炎癥 抗性可能是解決這一重大疾病最好的長期策略。 對(duì)豬 肺 組織炎癥抗性的基因表達(dá)調(diào)控和分子機(jī)制 目前還不 是很 清楚 , 這就嚴(yán)重阻礙了人們通 治療、免疫接種和遺傳選擇等途徑來顯著提高豬肺組織炎癥的整體抗性。本研究旨在通過分離和克隆與豬肺組織炎癥抗性相關(guān)基因的探索性研究，初步揭示參與肺組織炎癥抗性的基因種類和數(shù)量，為進(jìn)一步深入開展肺組織炎癥抗性的分子機(jī)理研究及將來通過遺傳選擇提高肺組織炎癥的抗性提供理論基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)中首先應(yīng)用抑制性消減雜交 (術(shù)成功構(gòu)建了豬病變肺組織 與健康 肺組織差異表達(dá) 大白豬為材料，分離 )+ 轉(zhuǎn)錄合成單鏈及雙鏈 酶切成為平均大小 150豬病變肺組織 成兩組，分別與 2種不同 的接頭連接，再與健康 肺組織 行 2 次消減雜交和 2 次抑制性 增，將第 2 次 體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 終構(gòu)建得到了具有高消減效率的豬肺組織炎癥抗性相關(guān) 庫擴(kuò)增后得到 422 個(gè)白色陽性克隆，隨機(jī)挑選 21 個(gè)克隆進(jìn)行 定，鑒 定結(jié)果表明插入片段主要分布在150500間。 隨后將從抑制性消減雜交過程中篩選到的初步差異表達(dá)的基因片段，經(jīng)過反 庫中高通量篩選得到 422 個(gè)差異表達(dá)的克隆。分別用地高辛標(biāo)記豬病變肺組織和無病變肺組織 為雜交探針，對(duì)構(gòu)建的 減文庫利用反向1 個(gè)差異表達(dá)克隆，測(cè)序后得到 34個(gè)質(zhì)量合格的 據(jù)在 將這些 類：第一類 代表已知基因，共 12 個(gè)；第二類代表已知 22個(gè) 。 代表已 知基因的 照基因功能分為 六 類：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞間通信、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞與機(jī)體防御、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻 譯與表達(dá)調(diào)控及其它。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)初步探討了部分豬肺組織炎癥相關(guān) 差異表達(dá)基因的作用和意義，其中豬免疫球蛋白重鏈基因 ( 核轉(zhuǎn)錄因子一 B)、 補(bǔ)體分子 鈣粒蛋白 ( 平滑肌激動(dòng)蛋白基因 ( 核糖體蛋白基因 ( ( 基因可能在豬肺組織炎癥抗性中發(fā)揮重要作用。 關(guān)鍵詞： 大白豬；肺組織炎癥抗性；抑制性消減雜交；基因表達(dá)；差異篩選； 庫 X ow is a is of to be in is in in is to XI be it of of in it to to of to to we in of A)+ 0 as )+ 50 00 as a of 8 h 00 CR CR . 422 of in 50bp in 1 of of in A 22 ( 41 4 A in nr ST ST 22, in on of is or an of of in on 、 an in in 目 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 吸系統(tǒng)及其肺損傷機(jī)制 . 1 吸系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及其與疾病的關(guān)系 . 1 損傷發(fā)生的機(jī)制 . 2 常見的呼吸系統(tǒng)疾病及其研究進(jìn)展 . 3 因差異表達(dá)的研究方法 . 4 示篩選 (. 5 消減雜交 (. 5 異顯示反轉(zhuǎn)錄 術(shù) (. 6 表性差示分析法 (. 6 因表達(dá)系列分析（ . 7 制性消減雜交 (. 7 互扣除 . 11 異消減展示（ . 11 陣列分析 (. 11 研究意義 . 12 第二章 構(gòu)建豬肺組織炎癥抗性相關(guān) 庫 . 13 言 . 13 料和方法 . 14 料 . 14 法 . 15 結(jié)果 . 26 部組織中總 . 26 鏈 成與酶切 . 27 頭連接效率檢測(cè) . 27 減產(chǎn)物第二次 果 . 28 減效率檢測(cè) . 29 減文庫中插入片段的 . 27 論 . 27 第三章 豬肺組織中差異表達(dá)基因片段的克隆測(cè)序和功能分析 28 言 . 28 料與方法 . 28 要試劑 . 28 要儀器設(shè)備 . 28 交所用溶液配制 . 29 異篩選探針的標(biāo)記 . 31 針標(biāo)記效率檢測(cè) . 33 入片段的擴(kuò)增與點(diǎn)膜 . 33 點(diǎn)雜交與顯色 . 34 異表達(dá)克隆選取 . 34 序 . 34 異表達(dá) . 35 果 . 35 針標(biāo)記效率檢測(cè)結(jié)果 . 35 點(diǎn)雜交篩選結(jié)果 . 35 3 4 結(jié)論 . 39 豬免疫球蛋白 . 38 核轉(zhuǎn)錄因子 基因 () . 38 補(bǔ)體 分子 . 42 鈣粒蛋白 ( . 42 a平滑肌激動(dòng)蛋白基因 (. 44 核糖體蛋白基因 ( (. 44 第四章 全文結(jié)論 . 45 參考文獻(xiàn) . 46 致 謝 . 55 附 錄 . 55 作者簡歷 . 56 英文 縮略詞 (英文 縮寫 英文全稱 中文 全稱 芐青霉素 部比對(duì)基本檢索工具 基對(duì) 補(bǔ)脫氧核糖核酸 DD 乙基焦 碳 酸鹽 ds 鏈互補(bǔ) B 溴化乙錠 二胺四乙酸二鈉 達(dá)序列標(biāo)簽 油醛 疫球蛋白重鏈可變區(qū) 丙基 - 道爾頓 使核糖核酸 OD 密度 酸鹽緩沖溶液 合酶鏈反應(yīng) 糖核酸 糖體 /分 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) of 因表達(dá)系列分析 細(xì)胞計(jì)數(shù) 二烷基磺酸鈉 化鈉 ss 鏈互補(bǔ) SH 制消減雜交 羥甲基氨基甲烷 43 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 吸系統(tǒng)及其肺損傷機(jī)制 吸系統(tǒng) 的 結(jié)構(gòu) 及其與疾病的關(guān)系 豬呼吸系統(tǒng)疾病與呼吸系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和免疫機(jī)制是密切聯(lián)系的。呼吸系統(tǒng)由鼻、咽喉、氣管、支氣管及其分支（細(xì)支氣管和呼吸性細(xì) 支氣管）組成的長長的呼吸道。大量的肺泡和肺泡囊附著在呼吸性細(xì)支氣管上。在由鼻到呼吸性細(xì)支氣管的管道系統(tǒng)中，管道的總面積逐級(jí)增大，到細(xì)支氣管這一級(jí)時(shí)，管道總面積已非常大，這種結(jié)構(gòu)影響氣流的速度，有利于塵埃和微生物的沉積。在吸入的各種病原因子作用下，肺內(nèi)細(xì)支氣管 首先是因?yàn)槲氩⒛艿竭_(dá)肺深部小顆粒（直徑 米）主要沉積在這一部位，其次是因?yàn)榉闻輧?nèi)排出的細(xì)胞性和非細(xì)胞性物質(zhì)經(jīng)過狹窄的細(xì)支氣管腔時(shí)，很容易在這個(gè)部位滯留。在外界不良條件作用和機(jī)體抵抗力下降時(shí)，如脫水、受寒 、細(xì)菌、病毒或寄生蟲感染、饑餓、吸入有毒氣體、代謝紊亂、肺瘀血、肺水腫等情況時(shí)，病原微生物則可入侵定居和繁殖，引起支氣管肺炎。 整個(gè)呼吸系統(tǒng)都有自己的非特異性屏障。從鼻到細(xì)支氣管黏膜都有一層單層柱狀纖毛上皮覆蓋，上皮層中有一些能分泌黏液的杯狀細(xì)胞，它所分泌的黏液能粘附微生物和氣源性顆粒，借助纖毛的擺動(dòng)將這些異物排出。此外黏液中還含有殺菌物質(zhì)，如溶菌酶、鐵蛋白及低分子肽等。溶菌酶對(duì)革蘭氏陽性菌，鐵蛋白對(duì)巴氏桿菌，低分子肽對(duì)胸膜肺炎放線桿菌和多殺性巴氏桿菌均具有很好的殺滅作用。肺泡壁沒有黏液，而是靠肺泡巨噬細(xì)胞 的吞噬作用及表面活性物質(zhì)來清除。但是這種清除作用對(duì)某些毒力較強(qiáng)的細(xì)菌如胸膜肺炎放線桿菌的清除作用不大，相反，這些毒力較強(qiáng)的細(xì)菌產(chǎn)生的毒素能使肺泡巨噬細(xì)胞失去活性，從而迅速定居增殖并引發(fā)疾病。多數(shù)西方學(xué)者認(rèn)為多殺性巴氏桿菌屬于繼發(fā)感染，而胸膜肺炎放線桿菌屬于原發(fā)感染。 另外，豬呼吸系統(tǒng)的疾病 與 呼吸系統(tǒng)的免疫應(yīng)答和免疫抑制 密切相關(guān) 。與胃腸道類似，呼吸系統(tǒng)的抗菌保護(hù)主要靠 使在有抗體存在時(shí)，那里也有大量的微生物群。 此不能激活 C3C5的生物功能或 C8介導(dǎo)的溶菌作用，其也沒有調(diào)理活性，因而 2 強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。在呼吸系統(tǒng)中， 反， 而使肺基本保持無菌。豬感染病毒、肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌時(shí)能引起呼吸道單核細(xì)胞的浸潤，具有細(xì)胞介導(dǎo)免疫的活性。在胸膜肺炎放線桿菌感染中，細(xì)胞介導(dǎo)免疫通過激活巨噬細(xì)胞而起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞介導(dǎo)免疫不存在時(shí)，抗放線桿菌抗體的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答是有害的。這是由于當(dāng)非活化的肺泡巨噬細(xì)胞攝取大量放線桿菌而又不能將其消化時(shí) ，被攝入的放線桿菌分泌出細(xì)胞毒素，使巨噬細(xì)胞失去活性。 一些免疫、自身免疫或代謝性的全身性疾病，如結(jié)節(jié)病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮肌炎、硬皮病等都可累及肺部。肺還具有非呼吸性功能，如肺癌異位性激素的產(chǎn)生和釋放所產(chǎn)生內(nèi)分泌綜合證。 肺損傷 發(fā)生的 機(jī)制 多種急性和慢性肺疾病伴有不同程度的肺部炎癥和肺纖維化統(tǒng)稱為肺間質(zhì)疾病 ,肺間質(zhì)纖維化是各種不同病因肺間質(zhì)疾病的共同結(jié)局 ,是呼吸衰竭的重要原因。對(duì)肺間質(zhì)纖維化 所造成的肺部組織損傷的發(fā)病機(jī)制的 始動(dòng)因素目前還不清楚 ,有人認(rèn)為與遺傳易感性、 病毒感染、免疫功能異常等有關(guān)。各種損傷因素?fù)p傷肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 ,引起肺泡巨噬細(xì)胞 (活化 ,單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì) 胞等炎癥細(xì)胞浸潤 ,炎癥細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子和炎癥遞質(zhì)介導(dǎo)了早期的肺損傷 。有以下炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與了早期的肺損傷過程 源的細(xì)胞因子 化后釋放的細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)在早期肺損傷中起主要作用。在肺損傷時(shí) , 1 ,腫瘤壞死因子 ( ,單核細(xì)胞趨化蛋白 (1 ,轉(zhuǎn) 化生長因子 ( ,血小板源生長因子 ( 、胰島素樣生長因子 ( 1 以及其他趨化因子和黏附分子。這些細(xì)胞因子一方面使炎癥細(xì)胞浸潤 ,化和成熟 ,另一方面促進(jìn)細(xì)胞因子和炎癥遞質(zhì)的進(jìn)一步分泌和表達(dá) ,形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò) ,引起肺泡炎和肺損傷。 單核細(xì)胞趨化因子 , 中性粒細(xì)胞趨化因子 , M ,并損傷肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。 致纖維化的生長因子 ,在早期分泌增多 ,同時(shí)啟動(dòng)肺纖維化的過程 ,形成不可逆性肺損 傷 （ C， 1996） 。 性粒細(xì)胞 近年來 ,中性粒細(xì)胞在肺泡炎和肺實(shí)質(zhì)損傷中的作用日漸引起重視 , 人和博萊霉素肺纖維化模型支氣管肺泡灌洗液 () 的中性粒細(xì)胞數(shù)目都明顯增高 （ M， 3 1995） 。中性粒細(xì)胞來源的活性氧化物和中性粒細(xì)胞崩解后釋放的蛋白水解酶既對(duì)肺組織有直接損傷作用 ,又能促進(jìn) 放其他細(xì)胞因子。 人肺纖維化程度與肺組織中中性粒細(xì)胞活性密切相關(guān) , 中中性粒細(xì)胞比值低、淋巴細(xì)胞比值高者對(duì)治療反應(yīng)好 ,預(yù)后好 。 他細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用 在早期肺損傷時(shí) ,上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是受到損傷的靶細(xì)胞 ,但受損傷后分泌的細(xì)胞因子又參與了肺損傷和肺纖維化。在鼠的博萊霉素肺纖維化模型中 ,肺泡型上皮細(xì)胞的 達(dá)增高 , 白表達(dá)增高 （ 宋明臣， 1998） ,上皮細(xì)胞和 內(nèi)皮素 ( 1 蛋白表達(dá)增高 （ E， 1998） ,嗜酸性粒細(xì)胞分泌 肺組織 達(dá)增 高 , 嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞有趨化作用 ,能夠刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成 , 夠誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞分化、增殖和活化。 人 蛋白表達(dá)增高 , 中 高 （ ， 1998） 。在鼠的博萊霉素肺纖維化模型中 ,肺內(nèi)和 中淋巴細(xì)胞升高 ,值升高 ,T 淋巴細(xì)胞的 達(dá)增高 ,抗 巴細(xì)胞單克隆抗體治療后肺纖維化減輕 ,表明淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也參與了肺損傷。核因子 B () 是調(diào)控炎癥 反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子 ,與炎癥性疾病密切相關(guān) ,在博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中 ,肺 活性增強(qiáng) ,伴有 達(dá)增高 ,在早期肺泡炎階段尤其明顯 （李永春 ，1999） 。 源的生長因子是肺損傷后過度修復(fù)和肺纖維化發(fā)生的重要原因。在修復(fù)階段 ,纖維化病灶附近的 纖維化病灶內(nèi)的成纖維細(xì)胞 能刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成 ,促進(jìn)膠原蛋白、纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖等在細(xì)胞外基質(zhì) 中沉積 ,減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解（ ， 1998） 。 是重要的致纖維化生長因子 ,能刺激平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。 總之 ,肺間質(zhì)纖維化是一種免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病 ,多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與了肺纖維化的發(fā)病過程 ,傳統(tǒng)的激素和免疫抑制劑治療仍是目前主要的治療手段 ,新的抗纖維化的藥物和細(xì)胞因子治療正在為肺纖維化的治療開辟新的途徑。 豬常見的呼吸系統(tǒng)疾病 及其研究進(jìn)展 豬 常見的呼吸系統(tǒng)疾病 從病理學(xué)上，按其發(fā)病部位，可分為 3種主要類型：鼻炎、肺炎 、胸膜炎。不同病原侵襲不同生理部位，造成靶器官損傷或全身各系統(tǒng)病征。在生產(chǎn)中，常見 4 的呼吸系統(tǒng)疾病可分為以下幾類：（ 1）細(xì)菌性呼吸系統(tǒng)疾病，主要有支原體肺炎（豬喘氣病，豬放線桿菌胸膜肺炎（ 豬鏈球菌病（ 進(jìn)行性萎縮性鼻炎（ 豬肺疫等；（ 2）病毒性呼吸系統(tǒng)疾病，主要有豬繁殖與呼吸系統(tǒng)障礙綜合癥（ 豬偽狂犬（ 豬流感（ ,豬瘟（ ；（ 3）細(xì)菌和病毒混合感染的呼吸系統(tǒng)疾病，主要有豬呼吸道疾病綜合征（ 豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（ ；（ 4）寄生蟲 性呼吸系統(tǒng)疾病，如由蛔蟲、后圓線蟲、肺絲蟲等引起的呼吸系統(tǒng)疾病。 目前對(duì)豬的呼吸系統(tǒng)疾病的防治 主要還是 根據(jù)各 豬 場(chǎng)實(shí)際情況，建立生物安全體系，制定相應(yīng)的技術(shù)和管理規(guī)范 措施來解決出現(xiàn)的疾病問題 ， 從分子遺傳角度來改善豬呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)抗性的研究 還比較少 見，但是 關(guān)于豬 呼吸系統(tǒng)方面的遺傳差異已有 多數(shù)研究 報(bào)道 ，呼吸障礙在某種程度上受遺傳影響 ，如：在基因選擇的肥胖豬中，發(fā)現(xiàn)肺臟的肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能比經(jīng)基因選擇的瘦肉型豬的效力強(qiáng)的多，這種差異在冬季和夏季時(shí)最明顯（ 1990） ； 有臨床觀察表明，純種漢普 夏豬（ 約克夏豬呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率低 （ ， 1986） ； 約克夏豬比長白（ 對(duì)萎鼻（ 易感性高 （ 1983） 。 到目前為止，對(duì)豬肺組織中抗病性遺傳機(jī)制及肺組織中與抗病性有關(guān)的基因研究還不多。 對(duì)于豬呼吸系統(tǒng)疾病的防治還沒有從根本的免疫機(jī)制和基因水平上去改變豬本身的免疫抗性， 可以通過研究豬呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)因子和基因， 采用細(xì)胞因子治療法和基因治療法，從根本上提高豬的整體抗病力 。 因差異表達(dá)的研究方法 基因的時(shí)空差異表達(dá)是有 機(jī)體發(fā)育、分化、衰老和抗逆等生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)?；蛟诓煌M織、不同器官以及不同環(huán)境條件下的差異表達(dá)特征為基因的功能提供了重要的信息。 高等生物大約 30000是同時(shí)表達(dá)的基因只有很小的一部分，約15%左右。 而這些基因的表達(dá)是按事件和空間順序有序地進(jìn)行著，這種表達(dá)的方式即為基因的差異表達(dá)。 基因的選擇表達(dá)，決定著整個(gè)生命過程中的發(fā)育，分化，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，刺激反應(yīng)，細(xì)胞周期調(diào)控，衰老以及程序化死亡等正常的發(fā)育過程 ， 另外， 在疾病中出現(xiàn)的病理性改變，無論是單一基因突變引起的或是多基因的復(fù)雜效 應(yīng)，也都是由基因表達(dá)的改變所決定的。因此，比較兩種不同類型細(xì)胞中基因表達(dá)的差異，就可探究造成這兩種細(xì)胞的表型差異的遺傳原因，提供研究生命過程的基本信息。 5 基因差異表達(dá)有兩種含義 ， 包括新出現(xiàn)的基因表達(dá)與表達(dá)量有差異的基因表達(dá)。 無論基因發(fā)生哪種差異表達(dá)，都會(huì)對(duì)其生理過程造成重要的影響。 研究基因差異表達(dá)的方法很多， 常用的方法 大致歸納如下幾種。 示篩選 (差別雜交 (叫差別篩選 (適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的 差別雜交的技術(shù)基礎(chǔ)十 分簡單，它不需要任何有關(guān)的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是 要 擁有兩種不同的細(xì)胞群體。在這種情況下便可制備到兩種不同的 此，可以通過這兩種總 是它們的 為探針的平行雜交，對(duì)由表達(dá)目的基因的細(xì)胞總 應(yīng)用差別雜交技術(shù)分離克隆的目的基因存在著諸多方面的局限性。首先，差別雜交的靈敏度比較低，特別是對(duì)于那些低豐度的 個(gè)缺點(diǎn)就顯得更加突 出。其次，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗費(fèi)時(shí)間和金錢的工作。況且兩套平行轉(zhuǎn)移的濾膜之間， 樣所得的雜交信號(hào)的強(qiáng)度也就不會(huì)一致，需要重新進(jìn)行點(diǎn)雜交，以作進(jìn)一步的陽性克隆鑒定工作。所以說重復(fù)性差是差別雜交篩選法的又一個(gè)缺點(diǎn)。 差別 雜 交技術(shù)在理論上很具吸引力 ,但實(shí)際操作并不容易 :首先是回收 并仍存在重復(fù)性差 ,敏感度低的缺點(diǎn) ,這些均限制了這一技術(shù)更廣泛的使用。 減雜交 (消減雜交又叫扣除雜交或 扣除 它是通過構(gòu)建扣除文庫 (以實(shí)現(xiàn)的。 1984年， 差異表達(dá)的基因通過檢測(cè)樣本 過量的對(duì)照樣本 相互雜交而得到 ， 是早期建立的經(jīng)典方法。該法通過構(gòu)建富含目的基因序列的 本質(zhì)是將共同擁有的序列消減掉，以富集目的基 因序列，提高分離的敏感性。 將消減雜交法的基本原理應(yīng)用于 兩個(gè)不同來源的 同樣可鑒別出只在一種 而鑒定出差異表達(dá)的基因。 另外， 扣除雜交法同樣也可以用來分離缺失突變基因。 該法對(duì)高豐度的 其適于分離由于缺失而造成的遺傳病的相關(guān)基 因；但很難獲得低豐度的差異基因，且存在重復(fù)性差、敏感性低的缺點(diǎn) 6 異顯示反轉(zhuǎn)錄 術(shù) (差異顯示反轉(zhuǎn)錄 術(shù)是 1992年 由 P,992)，它是以分子生物學(xué)上最廣泛應(yīng)用的兩種技術(shù) 基本原理是：以一對(duì)細(xì)胞 (或組織 )的總 用 過 5 端與 3 端引物的合理設(shè)計(jì)和組合，將細(xì)胞 (或組織 )中表達(dá)的約 15 000種基因片段直接顯示在 而找出一對(duì)細(xì)胞 (或組織 )中表達(dá)有差異的 同其它方法相比較 雖然 有很多優(yōu)點(diǎn) : l）簡單易行 2）靈敏度高 3）重復(fù)性好 4）多能性 5）快速 但在實(shí)際操作中仍 存在一些問題 ,主要表現(xiàn)在 : 1)出現(xiàn)差別條帶太多 ,假陽性率高達(dá) 70%左右 ,重復(fù)性差 ,且對(duì)高拷貝數(shù)的 2）在有差異的顯示片段中難以知道哪個(gè)基因是已經(jīng)研究過的，哪些是未知基因 。 3)得到的有差異的擴(kuò)增條帶短 ,一般在 110 4）以 )為引物的 所以差別顯示技術(shù)自 1992年建立后，一直在不斷進(jìn)行著改進(jìn)。第二代差異顯示系統(tǒng) :限制性酶切片段差異顯示（ 就是一個(gè)很有效的改進(jìn)。 是首先限 制性酶切 在酶切后的 是 異性 決了第一代差別顯示系統(tǒng)的重復(fù)性問題 ?？傊?， 點(diǎn)放大和展示編碼區(qū)，對(duì)原核及真核 大消除假陽性。 差異顯示技術(shù)經(jīng)過一系列的改進(jìn)，其假陽性率有了一定的下降，但是仍然無法完全解決 。 表性差示 分析法 (1993年， 1994年， 代表性差異分析法， 其目的在于減少假陽性，增加重復(fù)性。該技術(shù)充分發(fā)揮了 指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈模板，而以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過消減和富集，使目的基因片段得到特異性擴(kuò)增。 此技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是差異條帶在 陽性少 。 但是如果兩組間存在較大差異，以及某些基因在檢測(cè)子 (存在上調(diào)表達(dá)時(shí)，此方法顯得 7 力不從心， 達(dá)不到預(yù)期目的；而且 所需起始材料較多，更多信賴于 之間若存在較多差異，或 難達(dá)到預(yù)期目的，而且工作量比 期長 ；另外 操作步驟比較煩瑣，低豐度分子被擴(kuò)增的幾率仍很低，酶切連接步驟多， 能漏掉關(guān)鍵基因。 因表達(dá)系列分析（ 基因表達(dá)