RNA提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)

.一、槍頭和EP管等的消毒滅菌1、用去離子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（劇毒物），須在通風(fēng)櫥中小心使用，避光，密閉4保存;DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。經(jīng)檢測(cè)不含 RNase、DNase和proteinase。2、將槍頭和EP管放入0.1%的DEPC內(nèi)，保證槍頭和EP管內(nèi)都充滿0.1%的DEP,3、避光、靜置、過(guò)夜（12-24 h）4、裝槍頭和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，將槍頭或者EP管內(nèi)的DEPC水大致去除干后，裝起，包好5、121攝氏度，30min6、180攝氏度，干燥數(shù)個(gè)鐘頭（至少3小時(shí)以上）。注意：a、處理DEPC時(shí)需要戴乳膠手套、口罩！ b、或者不用DEPC消毒，130，90min高壓滅菌（許多實(shí)驗(yàn)室高溫滅菌兩次）二、RNA提取注意事項(xiàng)1、組織 RNA 抽提失敗的兩大現(xiàn)象是： RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問(wèn)題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA 不容易降解?，F(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡(jiǎn)單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹底裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過(guò)來(lái)講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問(wèn)題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時(shí)候更加會(huì)有此感覺(jué)。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒(méi)有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個(gè)問(wèn)題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快。電動(dòng)勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來(lái)說(shuō)，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來(lái)用電動(dòng)勻漿器的，改用液氮碾磨；原來(lái)用玻璃勻漿器的，改用電動(dòng)勻漿器或者直接用液氮碾磨，問(wèn)題幾乎 100% 能獲得解決。影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)殘留問(wèn)題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同?？傊绻霈F(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對(duì)具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)一些魚(yú)/雞之類(lèi)的小動(dòng)物，取相應(yīng)部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì) 用嘴碾磨，腸胃抽提。2、抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA 文庫(kù)構(gòu)建要求 RNA 完整而無(wú)酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對(duì) RNA 完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對(duì) RNA 完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財(cái)。3、樣品的收集/保存 影響降解的因素樣品離開(kāi)活體/或者原來(lái)的生長(zhǎng)環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開(kāi)始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來(lái)，再往下做。4、樣品的破碎及勻漿 影響降解和得率的因素樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來(lái)。細(xì)胞無(wú)須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過(guò)勻漿器一次完成破碎和勻漿過(guò)程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開(kāi)操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動(dòng)勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過(guò)程中，樣品不得融化，因?yàn)槔鋬龊髢?nèi)源酶更容易起作用。5、裂解液的選擇 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。6、純化方法的選擇 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素對(duì)于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對(duì)于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長(zhǎng)。7、RNA 抽提的“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意”紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。注意二：實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。注意三：實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。注意五：選擇合適的裂解液。注意六：控制好樣品的起始量。紀(jì)律三：明確自己的抽提目的注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功，而不是得率。8、RNase 污染的10大來(lái)源1）手指頭，手指頭是外源酶的第一來(lái)源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來(lái)源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。2）槍頭，離心管，移液器 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過(guò)的。移液器最好是專(zhuān)用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。3）水/緩沖液一定要確保無(wú) Rnase 污染。4）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。5）內(nèi)源 Rnase所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對(duì)有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。6）RNA 樣品RNA 抽提產(chǎn)物可能都會(huì)含痕量的 Rnase 污染。7）質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。8）RNA 保存即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會(huì)導(dǎo)致 RNA 降解。長(zhǎng)期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因?yàn)榇荚诘蜏貢r(shí)抑制所有的酶活性。9）陽(yáng)離子 （Ca， Mg）在含這些離子時(shí)，80C 加熱 5 分鐘會(huì)導(dǎo)致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加熱，保存液需要含螯合劑 （1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。10）后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶酶均有可能被 Rnase 污染。9、RNA 抽提的10大竅門(mén)1：快速阻止 Rnase 活性樣品收集后快速冷凍，裂解時(shí)快速操作滅活 Rnase。2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。3：預(yù)判質(zhì)量要求Northern，cDNA 文庫(kù)構(gòu)建對(duì)完整性要求高，RT-PCR， RPA （Ribonuclease protection assay） 對(duì)完整性要求不是很高。RT-PCR 對(duì)純度 （酶抑制物殘留） 要求很高。4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。5：檢查 RNA 的完整性電泳檢測(cè)，28S：18S =2：1 是完整的標(biāo)志，1：1 對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)也是可以接受的。6：去除 DNA用于 RT-PCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。7：降低外源酶的污染 不能從外面又導(dǎo)入酶。8：低濃度的核酸濃縮時(shí)，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。9：徹底溶解 RNA，必要時(shí)可以 65C 加熱 5 分鐘。10：合適的保存方法 短時(shí)間可以 20C 保存，長(zhǎng)期請(qǐng)保存于 80C。提高 RNA 得率首先要意識(shí)到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。高豐度 （2-4ug/mg） 的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度 （0.05-2ug/mg） 的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度 （ 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求了。A260/A280 是一個(gè)給大家?guī)?lái)許多困惑的指標(biāo)。首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/280 = 2.0 左右。純 RNA 是因，A260/A280 = 2 是果?，F(xiàn)在大家卻在拿 A260/A280 當(dāng)因用，認(rèn)為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會(huì)產(chǎn)生困惑。有興趣的話，可以在您的 RNA 樣品中加入一點(diǎn)抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚，異硫氰酸胍，PEG 等，再測(cè) A260/A280 比值?，F(xiàn)實(shí)是，許多抽提 RNA 時(shí)使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在 A260 和 A280 處附近有吸收，對(duì) A260/A280 產(chǎn)生影響。目前最具有指導(dǎo)性的做法是：對(duì) RNA 樣品在 200-300 nm 范圍掃描。純 RNA 的曲線具有如下特點(diǎn)：曲線平滑，A230 和 A260 是兩個(gè)拐點(diǎn)，A300 接近 0，A260/A280 = 2.0 左右，A260/A230 = 2.0 左右。如果沒(méi)有掃描數(shù)據(jù)，也一定要測(cè)定 A260/A230 比值，因?yàn)樵摫戎祵?duì)所有影響酶反應(yīng)的雜質(zhì)的殘留更敏感。要考慮設(shè)備的線形范圍 （A260 要處于 0.1 0.5 之間）。另外有兩個(gè)有用的現(xiàn)象：在水中測(cè)定 A260/A280，比值將變低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中測(cè)定的比值比在 1mM EDTA 中測(cè)定的高 0.2 左右。RNAguard：抑制組織/細(xì)胞內(nèi)源酶的試劑綜上所述，確保 RNA 不降解的傳統(tǒng)做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。碾磨過(guò)程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮以防止組織融化。待組織徹底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好揮發(fā)完時(shí)，立即將碾磨碎的組織移入裂解液中快速勻漿.安全的稱(chēng)重幾乎不可能。這么嚴(yán)格的操作，是沒(méi)有多少實(shí)驗(yàn)人員去認(rèn)真執(zhí)行的。RNAguard 能快速抑制樣品中的內(nèi)源酶活性，確保動(dòng)物組織/細(xì)胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一個(gè)月不降解，-20C 一年以上不降解。RNAguard適用的樣品包括：動(dòng)物組織，培養(yǎng)細(xì)胞