2006年自科基金.doc

國家自然科學(xué)基金申請書申請代碼：C03050309受理部門： 收件日期：受理編號：第 10 頁 版本1.002.910國家自然科學(xué)基金申 請 書您現(xiàn)在不能檢查保護(hù)文檔或打印文檔，請根據(jù)以下三個(gè)步驟操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用戶，請把Word宏的安全性設(shè)為:中 方法: Word菜單-工具-宏-安全性-安全級,設(shè)置為中 (如果您是Word97用戶，繼續(xù)執(zhí)行以下步驟) 2)關(guān)閉本文檔，重新打開本文檔 3)點(diǎn)擊啟用宏按鈕，即可開始填寫本文檔或打印了資助類別：面上項(xiàng)目亞類說明：自由申請項(xiàng)目附注說明： 項(xiàng)目名稱：天灸對Lewis肺癌化療小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因表達(dá)及其免疫功能的影響申 請 者：王勇 電話： 053182614117 依托單位：山東中醫(yī)藥大學(xué) 通訊地址：濟(jì)南市經(jīng)十路53號 郵政編碼：250014 單位電話電子郵件： 申報(bào)日期： 2006年5月20日國家自然科學(xué)基金委員會(huì)基本信息1YThcng7申 請 者 信 息姓名性別男出生年月1972年3月民族漢族學(xué)位博士職稱主任醫(yī)師主要研究領(lǐng)域刺法灸法的研究 電話053182614117 電子郵件 傳真 個(gè)人網(wǎng)頁 工作單位山東中醫(yī)藥大學(xué) /針灸推拿學(xué)院在研項(xiàng)目批準(zhǔn)號 依托單位信息名稱代 碼25001405 聯(lián)系人齊冬梅 電子郵件 電網(wǎng)站地址http：/ 合作單位信息單 位 名 稱代 碼90000133 25000101 項(xiàng) 目 基 本 信 息項(xiàng)目名稱資助類別面上項(xiàng)目 亞類說明自由申請項(xiàng)目 附注說明 申請代碼C03050309:中醫(yī)針灸學(xué)(含針刺鎮(zhèn)痛等) 基地類別 預(yù)計(jì)研究年限2006年7月 2007年5月研究屬性應(yīng)用基礎(chǔ)研究 申請經(jīng)費(fèi)38.5000萬元摘 要(限400字)：肺癌在我國發(fā)病率很高，但肺癌患者的 5 年生存率只有 10%，約 70-80%的肺 癌患者接受化療。因抗癌藥物治療指數(shù)狹小所引起的不良反應(yīng)往往限制了癌癥治療的最佳用藥。因此防治化療反應(yīng)越來越受人們重視,本實(shí)驗(yàn)通過研究移植性 Lewis肺癌小鼠經(jīng)天灸治療和順鉑化療后機(jī)體的免疫功能和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的表達(dá)了解天灸在肺癌治療過程中的增效減毒作用.本實(shí)驗(yàn)采用 MTT 法檢測 Lewis 肺癌化療小鼠脾臟 NK 細(xì)胞活性，采用放射免 疫分析法檢測 Lewis 肺癌化療小鼠外周血白細(xì)胞介素-2（IL-2）水平，研究天灸 對小鼠免疫功能的影響。此研究的意義在于為天灸在臨床治療肺癌過程中的增效減毒作用提供理論依據(jù)，為中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌方面進(jìn)行一些有益的嘗試。 關(guān) 鍵 詞(用分號分開，最多5個(gè))天灸； Lewis 肺癌； 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因表達(dá)； 免疫功能 項(xiàng)目組主要成員（注: 項(xiàng)目組主要成員不包括項(xiàng)目申請者，國家杰出青年科學(xué)基金類項(xiàng)目不填寫此欄。）編號姓 名出生年月性別職 稱學(xué) 位單位名稱電話電子郵件項(xiàng)目分工每年工作時(shí)間（月）11964-12-11 男教授博士山東中醫(yī)藥大學(xué) 053182914116 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人 4 21972-3-24 男實(shí)驗(yàn)師碩士山東省中醫(yī)藥研究院 053182617115 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 4 31969-5-13 男副教授博士山東中醫(yī)藥大學(xué) 053182924577 動(dòng)物造模及實(shí)驗(yàn) 5 41965-01-02 男副教授博士山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 053182615221 基因檢測 5 56789總?cè)藬?shù)高級中級初級博士后博士生碩士生10221041說明: 高級、中級、初級、博士后、博士生、碩士生人員數(shù)由申請者負(fù)責(zé)填報(bào)（含申請者），總?cè)藬?shù)自動(dòng)生成。經(jīng)費(fèi)申請表 （金額單位：萬元）科目申請經(jīng)費(fèi)備注（計(jì)算依據(jù)與說明）一.研究經(jīng)費(fèi)34.500034.50001.科研業(yè)務(wù)費(fèi)5.00005.0000（1）測試/計(jì)算/分析費(fèi)0.5000數(shù)據(jù)軟件分析（2）能源/動(dòng)力費(fèi)0.7000電費(fèi)、交通費(fèi)、手機(jī)費(fèi)，平均每月300元（3）會(huì)議費(fèi)/差旅費(fèi)0.6000參加學(xué)術(shù)會(huì)議3次（4）出版物/文獻(xiàn)/信息傳播費(fèi)1.8000文獻(xiàn)檢索、購買相關(guān)書集、復(fù)印資料，發(fā)表學(xué)術(shù)論文6篇（5）其它1.4000成果鑒定2.實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)25.000025.000（1）原材料/試劑/藥品購置費(fèi)21.0000天灸膏、順鉑（2）其它4.0000動(dòng)物購置、飼養(yǎng)費(fèi)及手術(shù)器械、用品費(fèi)用3.儀器設(shè)備費(fèi)0.0000（1）購置（2）試制4.實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi)5.協(xié)作費(fèi)4.5000檢測Lewis 肺癌化療小鼠外周血白細(xì)胞介素-2（IL-2）水平二.國際合作與交流費(fèi)0.00001.項(xiàng)目組成員出國合作交流2.境外專家來華合作交流三.勞務(wù)費(fèi)2.0000四.管理費(fèi)2.0000合 計(jì)38.5000與本項(xiàng)目相關(guān)的其他經(jīng)費(fèi)來源國家其他計(jì)劃資助經(jīng)費(fèi)0.0000其他經(jīng)費(fèi)資助（含部門匹配）0.0000其他經(jīng)費(fèi)來源合計(jì)0.0000報(bào)告正文（一）立項(xiàng)依據(jù)與研究內(nèi)容：1、項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)（附主要的參考文獻(xiàn)目錄）：肺癌的發(fā)病率在我國居常見腫瘤的前列，而且絕大多數(shù)肺癌患者就診時(shí)腫瘤 已達(dá)晚期，大部分病人失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)。目前，化療是治療腫瘤的重要方法，約 70-80%的肺癌患者接受化療1?；煖p輕病情的同時(shí)也對正常組織細(xì)胞、臟器 的生理功能有一定程度的破壞作用,并抑制機(jī)體的免疫功能和骨髓造血功能等, 從而影響化療的繼續(xù)進(jìn)行。因此,防治化療毒性反應(yīng)是癌癥治療的重要課題。天灸是將具有刺激性的藥物貼敷在穴位上，使局部皮膚充血、發(fā)泡，甚至化 膿，有如灸瘡，故曰天灸。天灸通過刺激相應(yīng)的腧穴或患處，調(diào)理臟腑，行氣活 血，調(diào)和陰陽，達(dá)到治療疾病目的的一種外治法。因?yàn)槠淇梢砸鹌つw局部起泡 所以也叫做“發(fā)泡灸”；相對于火灸、艾灸來講，因?yàn)椴恍枰獰嵩矗砸步凶?“冷灸”；利用藥物本身對皮膚的刺激性就可以達(dá)到灸的效果，所以也叫做“自 灸”。天灸是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中較為獨(dú)特的外治法，有數(shù)千年的歷史，一直沿用至今， 現(xiàn)也稱為穴位藥物貼敷療法。它將中醫(yī)透皮給藥與經(jīng)絡(luò)穴位相結(jié)合，通過藥物刺 激經(jīng)絡(luò)、腧穴，對機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)在的調(diào)節(jié)作用，從而達(dá)到治療疾病的目的?，F(xiàn)代研 究認(rèn)為，天灸對皮膚產(chǎn)生刺激，擴(kuò)張毛細(xì)血管，改善局部血液循環(huán)；刺激皮膚的 神經(jīng)感受器，通過神經(jīng)反射達(dá)到提高機(jī)體免疫力的作用。另一方面由于天灸集艾 灸、中藥于一體，可以使腧穴局部自動(dòng)加熱有利于藥物的吸收，藥物的有效成份 經(jīng)皮膚表面的角質(zhì)層、毛囊皮脂腺及汗管等滲透吸收進(jìn)血液、淋巴液、內(nèi)分泌液 中，發(fā)揮一定的藥理作用。 天灸療法越來越受到學(xué)者和專家們的重視，尤其是近十幾年來，在理論探討 和臨床應(yīng)用等方面，均有突破性的創(chuàng)新，并開始用于疑難雜癥的治療。例如趙氏2 觀察天灸治療非感染性尿道綜合征，與西藥組比較，天灸組痊愈 13(40.6%)好轉(zhuǎn) 14(43.7%)無效 5(15.7%)總有效率 84.3%；對照組痊愈 2（6%）好轉(zhuǎn) 9(33%)無效 19(61%)總有效率 39%。兩組比較差異有顯著性（P0.01）。說明天灸在治療 尿道綜合癥方面有明顯的優(yōu)勢。發(fā)泡療法用于治療慢性氣管炎3和支氣管哮喘9有大 量報(bào)導(dǎo)，還有用于三叉神經(jīng)痛4、過敏性鼻炎56、乳腺纖維囊腫7、腮腺炎、風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、硬皮病8、肩周炎10、肱骨外上髁炎11、慢性乙型肝炎12、獲得性寒冷性蕁麻疹、 額竇炎、梅核氣、慢性潰瘍性結(jié)腸炎、強(qiáng)直性脊椎炎13、胃脘痛14均獲得滿意的療效，臨床例證不勝枚舉。在基礎(chǔ)理論研究方面，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，天灸可調(diào)節(jié)化療 大鼠下丘腦、垂體中-內(nèi)啡肽（-Ep）水平15，改善環(huán)磷酰胺大鼠的造血功能和 免疫功能，提高荷瘤小鼠的T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力和NK細(xì)胞1617、腫瘤壞死因子（TNF）的殺傷活性下者升高，趨向協(xié)調(diào)平衡，正是內(nèi)經(jīng)“陰平陽秘，精神乃治”理論的體現(xiàn)。本研究選擇肺癌作為研究對象，一是因?yàn)榉伟┦俏覈畛Ｒ姷哪[瘤之一，積極開展中西醫(yī)結(jié)合防治肺癌研究具有較大的現(xiàn)實(shí)意義；二是約 70-80%的肺癌患者接受化療?；煖p輕病情的同時(shí)也對正常組織細(xì)胞、臟器的生理功能有一定程度的破壞作用,并抑制機(jī)體的免疫功能和骨髓造血功能等, 從而影響化療的繼續(xù)進(jìn)行。因此,防治化療毒性反應(yīng)是癌癥治療的重要課題，而天灸正是防治化療毒性反應(yīng)的臨床和基礎(chǔ)行之有效的方法。本實(shí)驗(yàn)通過研究移植性 Lewis肺癌小鼠經(jīng)天灸治療和順鉑化療后機(jī)體的免疫功能和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的表達(dá)了解天灸在肺癌治療過程中的增效減毒作用.本實(shí)驗(yàn)采用 MTT 法檢測 Lewis 肺癌化療小鼠脾臟 NK 細(xì)胞活性，采用放射免 疫分析法檢測 Lewis 肺癌化療小鼠外周血白細(xì)胞介素-2（IL-2）水平，研究天灸 對小鼠免疫功能的影響。此研究的意義在于為天灸在臨床治療肺癌過程中的增效減毒作用提供理論依據(jù)，為中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌方面進(jìn)行一些有益的嘗試。參考文獻(xiàn)：1 張小東譯;腫瘤治療學(xué).人民衛(wèi)生出版社,2001.4,421-4282趙立巖,李南玲,天灸治療非感染性尿道綜合征 32 例臨床觀察,中國中西 醫(yī)結(jié)合雜志,2003，23(11):822. 3 左愛欣,三伏天灸治療慢性支氣管炎 150 例,河北中醫(yī),1997，19(2):37.4 周念興,天灸療法治療三叉神經(jīng)痛臨床觀察,實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,1995， 9(2):34. 5 夏 翠 霞 , 三 伏 天 灸 治 療 過 敏 性 鼻 炎 360 例 , 遼 寧 中 醫(yī) 雜 志,1996,23(4):184. 6 史正耀,大蒜天灸治療過敏性鼻炎 120 例,陜西中醫(yī),1997，18(1):31.7 汪慧敏,貼敷加天灸治療乳腺纖維囊腫,浙江中醫(yī)雜志,1997，32(8):374. 8 劉玉環(huán),張仁尊,崔淑杰,天灸治療硬皮病,針灸臨床雜志,1997， 13(3):39-40. 9 王建新,天灸療法防治支氣管哮喘 72 例臨床小結(jié),現(xiàn)代中醫(yī),1997， 10(3):161-163.10 章進(jìn),太淵穴天灸方治療肩周炎 48 例,中醫(yī)外治雜志,1998，7(6):14-15.11 高素秋,天灸治療肱骨外上髁炎 100 例,江蘇中醫(yī),1999，20(6):39. 12 陳海英,林咸明,劉勇,天灸結(jié)合穴位注射治療慢性乙型肝炎療效與 HB， DNA 含量之間的關(guān)系,中國針灸,1999，19(12):729-730. 13 楊平梅,天灸發(fā)泡法治療風(fēng)濕痹癥,針刺研究,2000，25(2):151-152.14 袁堅(jiān)榮,劉炳權(quán),天灸治療虛寒性胃痛 365 例臨床觀察,針灸臨床雜 志,2001，17(8):52. 15 孫德利,方劍喬,陳華德,天灸對環(huán)磷酰胺大鼠-內(nèi)啡肽含量的影響,中國中醫(yī)藥科技,20018(5):279-280. 16 韓毳,李學(xué)武,劉震,天灸抗小鼠移植性腫瘤作用及對免疫功能的影響,天津中醫(yī),200118(5):30-31. 17 孫德利,陳漢平,吳煥淦,天灸對小鼠造血功能的影響及其機(jī)理的探討,針 刺研究,1999，24(3):206-211.2.項(xiàng)目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo)以及擬解決的關(guān)鍵問題。2.1研究內(nèi)容：（1）天灸對 Lewis 肺癌化療小鼠的減毒作用。（2）天灸對 Lewis 肺癌化療小鼠脾 NK 細(xì)胞活性及血清 IL-2 水平的研究。（3）天灸對 Lewis 肺癌化療小鼠的癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移及 nm23-M1 基因表達(dá)的研究。2.2研究目標(biāo)： 通過天灸腎俞穴，觀察其對Lewis肺癌小鼠體重變化、飲食情況、脾臟NK細(xì)胞活性、血清IL-2水平、腫瘤組織形態(tài)學(xué)、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因（nm23-M1）的蛋白表達(dá)、nm23-M1基因的 mRNA 表達(dá)的影響，為開拓天灸防治化療反應(yīng)提供基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2.3擬解決的關(guān)鍵問題：（1）腎俞穴在小鼠身上的定位。（2）小鼠脾臟NK細(xì)胞活性、小鼠血清IL-2水平的測定。（3）腫瘤組織形態(tài)學(xué)的觀察。（4）腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的蛋白表達(dá)。（5）nm23-M1基因的mRNA表達(dá)3.擬采取的研究方案及可行性分析：3.1研究方案：（1）參照林文注主編的實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)大鼠的腎俞穴的定位。（2）用MTT法和用放射免疫分析法：MTT法：制備脾細(xì)胞：貼敷治療結(jié)束后隔日取材, 摘眼球取血，脫頸處死小鼠，75% 乙醇溶液浸泡消毒，無菌取脾，置于少量冷不完全 1640 培養(yǎng)液中（按 10.4g 加 1000ml 雙蒸水、加入終濃度為 20mM 的 HEPES、16mM 的 NaHCO3、1mM 的丙酮酸鈉, 配成不完全 1640 培養(yǎng)基,過濾除菌；），研磨，200 目篩網(wǎng)過濾，濾液移入 50ml 離心管， 1500r/min 4離心 10 min。棄上清，以無菌 Tris-NH4Cl 溶液（Tris， 以雙蒸水配成 0.17M 溶液，用鹽酸調(diào) PH 至 7.2-7.4；NH4Cl，以雙蒸水配成 0.16M 溶液，4保存?zhèn)溆谩ＥR用時(shí)二者以體積比 1:9 混合成工作液。）作用 10min 破壞 紅細(xì)胞，同上法離心后棄上清，冷不完全 1640 培養(yǎng)液重懸，洗滌 2 次，洗滌后 用完全1640培養(yǎng)液（不完全1640培養(yǎng)液臨用時(shí)加入100 u/ml的青霉素和100 g/ml 的鏈霉素、2mM 的 L-谷氨酰胺，配成含 10%滅活胎牛血清的完全 1640 培養(yǎng) 基。）重懸并調(diào)細(xì)胞濃度為 1107/ml,并對倍稀釋至 5106/ml、1.25106/ml， 加入 96 孔板中（0.1ml/孔）作為效應(yīng)細(xì)胞。. 制備靶細(xì)胞：將傳代 24H 生長良好的 YAC-1 細(xì)胞（5104/孔）作為靶細(xì) 胞，分別設(shè)為 100:1、25:1 效靶比，并設(shè)效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞對照。振蕩混勻，5% CO2 37孵育 20 小時(shí)，棄上清 100l/孔，加入 MTT 溶液 （以 PH7.2 的 PBS 配成 5mg/ml 溶液，過濾除菌，-20保存。）10l/孔，繼續(xù) 孵育 4 小時(shí)。取出后加入 MTT 溶解液（0.01N HCl-10% SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用,以 0.01N 鹽酸配 10% SDS 溶液）100l/孔，振蕩混勻，37孵育過夜，使顆粒完全溶解。在酶標(biāo)儀上以 570nm 波長測定 OD 值。 公式：NK 細(xì)胞活性1-（實(shí)驗(yàn)孔 OD 值-效應(yīng)細(xì)胞對照孔 OD 值）/靶細(xì)胞對 照孔 OD 值100% 。放射免疫分析法： 摘眼球取血，室溫凝固，4，離心，3000rpm，10min，取血清測定。嚴(yán)格 按試劑盒說明書加液，采用平衡法，在計(jì)數(shù)器上測定 cpm 數(shù)，以 B/T 計(jì)算 NSB、 S0 結(jié)合百分率，以 B/B0 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)及待測樣品結(jié)合百分率，計(jì)數(shù)器描繪標(biāo)準(zhǔn)曲 線，自動(dòng)計(jì)算出樣品（IL-2）值，和樣品濃度。（3）HE染色，光鏡觀察：小鼠的腫瘤組織，切成 2mm 厚，放入 10%福爾馬林溶液內(nèi)固定。用低溫石蠟 包埋，4祄 連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟至水;蘇木素染色 10m; 1%鹽酸酒精分 化; 流水沖洗 2h 藍(lán)化; 脫水 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇各 5m，95%乙醇 15m; 入伊紅酒精溶液 5m;95%乙醇5m;100%乙醇5m;100%乙醇5m; 透 明:二甲苯15m;二甲苯15m; 中性樹膠封片，室溫晾干，光鏡下觀察。（4）用免疫組織化學(xué)法：切片常規(guī)脫蠟至水;3%H2O2 室溫滅活內(nèi)源性過氧化物酶 10min,蒸餾水洗 3 次;微波抗原修復(fù):切片浸入 1mmol/LEDTA（PH8.0）液中,微 波爐中加熱至 100,5min,冷卻后再加熱至 100,5min,冷卻;滴加抗原修復(fù) 液,室溫 10min, PBS 沖洗 3 次;血清封閉,室溫 20min;滴加一抗 1：100 稀釋 的一抗 nm23-M1，30l，4過夜。PBS 洗 5min3 次。同時(shí)用 PBS 代替一抗作 陰性對照;滴加生物素化山羊抗兔 IgG,37,20min, PBS 洗 5min3 次;滴加 試劑 SABC,3720min, PBS 洗 5min4 次;DAB 顯色, 室溫 5-30m，光鏡下控制 時(shí)間。常規(guī)脫水,透明, 中性樹膠封片。計(jì)算機(jī)圖象分析 nm23-M1 表達(dá)的面積 與整個(gè)視野的面積比。（5）采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法：從組織中提取總 RNA。 腫瘤組織加 Trizol 后（100mg 組織/1ml Trizol），用槍頭充分?jǐn)噭?dòng)以使液 體粘稠，室溫放置 5 分鐘，使其充分裂解。4 12000g 離心 15 分鐘，取上清。 按 200l 氯仿/mlTrizol 加入氯仿（預(yù)冷），充分搖勻 15 秒，室溫放置 15 分鐘。4 12000g 離心 15 分鐘。 吸取上層水相，至另一個(gè)預(yù)冷的離心管中。 按 0.5ml 異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇（預(yù)冷）混勻，室溫放置 5-10min。 4 12000g 離心 10min，棄上清，RNA 沉于管底。 按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇（預(yù)冷），溫和震蕩離心管，懸浮 沉淀。 4 7500g 離心 5min，盡量棄上清。室溫晾干 5-10min。用 50l RNase-free H2O,溶解 RNA 樣品，55-60 10min。-80保存待測。用分光光度法測定所提取 RNA 的濃度 分光光度計(jì)先用 1ml 水校正零點(diǎn)。比色杯使用前用濃鹽酸:甲醇（1:1）浸泡 1 小時(shí)，隨后用經(jīng) DEPC 處理高壓消毒過的水徹底沖洗。吸取 6l RNA 樣品，加 水至 1.5ml 混勻后，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。 在 260nm 和 280nm 分別讀出光密度，260nm /280nm 在 1.8-2.0 之間。 RNA 樣品的濃度按以下公式計(jì)算：OD260核酸稀釋倍數(shù)40/1000；濃度單位為 g /l 。RNA 電泳檢測 RNA 的完整性（1.0%瓊脂糖凝膠）。mRNA 反轉(zhuǎn)錄，用 Reverse Transcription System 試劑盒，嚴(yán)格按說 明書操作。 取出 RNA 模板、試劑，于室溫融化后，立即放在冰浴中，混旋器上混勻，短 暫離心。Template RNA xl（1g），加 DEPC 處理過的水至10l，70溫浴 10 分鐘，立即放在冰浴中至少 1 分鐘。 配制反應(yīng)混合液(每管按下述量配制)：MgCl2，25mM（4.0l）、 Reverse Transcription 10buffer （2.0l）、10mM dNTP Mix（2.0l）、 RNase Inhibitor （40U/l）（0.5l）、AMV Reverse Transcriptase（20U/l）（0.75l）、 Oligo（dT）15 primer 0.5g/l （1.0l）。 混合均勻，每管加 10l 的上述混合液 用加樣槍上下輕輕混勻。 42溫浴，15 分鐘。 95溫浴，5 分鐘，放在冰上 5 分鐘。 -80保存待測。熒光定量 PCR 檢測，試劑：SYBR Green PCR Master Mix，ABI(Applied Biosystems)，引物序列：根據(jù)美國基因生物庫提供小鼠基因核酸序列，選取 G C 含量約 50%的無發(fā)卡結(jié)構(gòu)，相互間無同源序列兩段特異性保守序列，引物采 用 primer premier5.0 設(shè)計(jì)，由賽百盛公司合成。設(shè)計(jì)引物如下： Nm23-M1-FP: 5-CTAGAATGACATCCGACTCC-3。 Nm23-M1-RP: 5-TTGAGAAGGTCCTCTGAAGC-3 擴(kuò)增片段為 333bp。照基因引物-actin-FP: 5-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3 -actin-RP: 5-AATGTCACGCACGATTTCCC-3 擴(kuò)增片段為 263bp。 每個(gè)反應(yīng)管中混合液（包括模板、引物）體積 V25l，設(shè)兩管陰性對照 （一例陰性標(biāo)本對照，一例只含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的對照）,標(biāo)準(zhǔn)曲線（用樣品梯 度稀釋）,在 PCR 儀 96 孔反應(yīng)板上放好，并記錄位置。 擴(kuò)增反應(yīng)在 GeneAmp 5700 熒光定量 PCR 儀進(jìn)行，反應(yīng)條件如下： 95.0C 10min；94.0C 20sec、58.0C 20sec、 72.0C 45se 共循環(huán) 45 次； 72.0C 延伸 8min。以上反應(yīng)設(shè)定均在與 PCR 儀相連的計(jì)算機(jī)上進(jìn)行，每個(gè)循環(huán) 電腦自動(dòng)記錄反應(yīng)管中的熒光信號值，并描繪曲線。反應(yīng)結(jié)束由 PE 5700 軟件分 析結(jié)果，自動(dòng)計(jì)算定量數(shù)值。電泳分析：對定量 PCR 檢測為陽性反應(yīng)管中的產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝 膠 80V 電泳 45-60 分鐘,用凝膠圖像分析儀采集圖像。標(biāo)記分子量為:80，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1030bp。3.2可行性分析：（1）腎俞是足太陽膀胱經(jīng)的穴位，是腎氣輸注于體表的部位，具有較好的培補(bǔ)腎元的功效，先天得充則后天得養(yǎng)，對于提高機(jī)體的防治化療毒性反應(yīng)有很好的作用。（2）本課題組成員學(xué)歷、年齡結(jié)構(gòu)合理，具有較扎實(shí)的理論基礎(chǔ)和熟練的操作技能。（3）本課題組對天灸的理論知識和臨床應(yīng)用具有扎實(shí)的基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)室能熟練的操作MTT法和用放射免疫分析法、HE染色，光鏡觀察、用免疫組織化學(xué)法、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法。（4）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J 近交系小鼠，78 周齡，體重 1721g，60 只，雌雄各半，清潔 級。動(dòng)物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究中心提供。 因此，本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目可行性強(qiáng)，可按期保質(zhì)完成。4. 本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。 本項(xiàng)目的特色在于：采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)將天灸腎俞穴在抗腫瘤化療中的增效減毒作用機(jī)制、加強(qiáng)化療對 Lewis 肺癌小鼠癌細(xì)胞生長的抑制作用、對化療小鼠免疫功能有調(diào)節(jié)作用、對化療小鼠 nm23-M1 基因表達(dá)的促進(jìn)作用比較客觀的表示出來。 本項(xiàng)目的創(chuàng)新在于：（1）首次開展天灸對肺癌化療小鼠腫瘤組織的 nm23-M1 基因蛋白含量的研究。（2）首次開展天灸對肺癌化療小鼠腫瘤組織的 nm23-M1 基因 mRNA 表達(dá)的研 究。 本實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)天灸療法為研究目標(biāo)，運(yùn)用現(xiàn)代免疫學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)等現(xiàn) 代科學(xué)手段，開展了天灸“腎俞”穴對抗腫瘤化療增效減毒機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，更深入探討了天灸的治病機(jī)理并取得了重要的研究成果。目前這方面的研究達(dá)到分 子水平、基因水平的研究較少，我們運(yùn)用基因?qū)W技術(shù)，將“天灸療法”的實(shí)驗(yàn)研 究提高到新的水平。豐富了中醫(yī)天灸理論。隨著進(jìn)一步研究，將天灸與化療藥物 作用有機(jī)結(jié)合，將開發(fā)出有效的化療藥物減毒增效劑和減毒增效方法。5.年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果。5.1年度研究計(jì)劃： 2006.72006.8 完成試驗(yàn)材料和試劑的準(zhǔn)備，查閱資料，查新檢索。 2006.92006.10 完成小鼠脾 NK 細(xì)胞活性及血清 IL-2 水平的測定。 2006.112007.1 完成腫瘤組織形態(tài)學(xué)的觀察、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的蛋白表達(dá)和nm23-M1基因的mRNA表達(dá)。 2007.22007.5 課題總結(jié)、鑒定并申報(bào)成果。5.2 預(yù)期研究結(jié)果：（1）天灸療法可以使小鼠血清 IL-2 含量升高，脾臟 NK 細(xì)胞活性增強(qiáng)，天灸組的 NK 細(xì)胞活性最強(qiáng)（2）天灸對化療小鼠 nm23-M1 基因表達(dá)有促進(jìn)作用。（3）天灸療法對 Lewis 肺癌化療小鼠有減毒作用：抑制化療肺癌小鼠體重減輕，食欲降低，飲食量減少。（4）所獲研究成果，擬在國家級刊物發(fā)表學(xué)術(shù)論文56篇，及時(shí)進(jìn)行成果鑒定，并申報(bào)科技進(jìn)步獎(jiǎng)。（二）研究基礎(chǔ)與工作條件1. 工作基礎(chǔ)1.1 研究工作積累 實(shí)踐積累：2000多年的實(shí)踐證明，天灸對虛弱疾病患者（本實(shí)驗(yàn)為移植性 Lewis肺癌小鼠）機(jī)體的恢復(fù)有很好的效果。 理論積累：通過對國內(nèi)有關(guān)天灸治療研究情況進(jìn)行檢索，掌握了該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，從而選擇恰當(dāng)?shù)那腥朦c(diǎn)進(jìn)行研究。 技術(shù)積累：本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完全掌握了天灸技術(shù)的操作，掌握了分子生物學(xué)、現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)，為完成本實(shí)驗(yàn)打下了良好的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。1.2 已取得的研究工作成績 已經(jīng)初步經(jīng)實(shí)驗(yàn)得知天灸腎俞可以提高大鼠的造血功能，試驗(yàn)結(jié)果表明可以提高大鼠自身的免疫能力。2. 工作條件 山東中醫(yī)藥大學(xué)、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、山東省中醫(yī)藥研究所具備了與本次實(shí)驗(yàn)相關(guān)的儀器，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究中心提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J 近交系小鼠，78 周齡，體重 1721g，60 只，雌雄各半，清潔 級。本校實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心有良好的SPF級動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)備和條件。設(shè)備和設(shè)施完全滿足本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)所需。3. 申請人簡歷 王勇，男，1972年3月出生。1995年畢業(yè)于山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸專業(yè)，獲碩士學(xué)位。1998年畢業(yè)于山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸專業(yè)，獲博士學(xué)位，主任醫(yī)師，一直從事中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤的工作。近期發(fā)表的于本課題有關(guān)的論文有： 1. 王勇. 天灸的歷史沿革. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 2003；10（1）：48 2. 王勇. 天灸的臨床應(yīng)用綜述. 中國針灸雜志2005；21（1）：4在本項(xiàng)研究中負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、組織實(shí)施、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集、整理、統(tǒng)計(jì)等工作。程勇，男，1964年12月11日生。1990年畢業(yè)于大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤病理專業(yè)，獲醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位，2000年畢業(yè)于山東中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合腫瘤專業(yè)，獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，主任醫(yī)師，