聚丙烯酰胺凝膠 配制方法.doc

5TBE（組份濃度：5TBE，pH 8.3；配制量：1 L）：稱取53.9 g Tris，27.5 g硼酸，量取20 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），置于1 L燒杯中；加入約800 ml超純水，充分攪拌溶解；加超純水將溶液定容至1 L；室溫保存。10% 過硫酸銨（組份濃度：10% (W/V) 過硫酸銨；配制量：10 ml）：稱取1 g過硫酸銨，置于1050 ml燒杯中；加入約8 ml超純水，攪拌溶解；加超純水將溶液定容至10 ml；4 保存（保存時間為2周左右，超過期限過硫酸銨將失去催化作用）。30% 丙烯酰胺（組份濃度：30% (W/V)丙烯酰胺；配制量：1 L）：稱取290 g丙烯酰胺，10 g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺，置于1 L燒杯中；加入約600 ml超純水，水浴加熱至37 ，充分攪拌至溶解；加超純水將溶液定容至1 L，用0.45 m濾膜過濾除去雜質；并檢測該溶液pH值應不大于7；棕色瓶4 保存。0.1% AgNO3（組份濃度：0.1% (W/V) AgNO3；配制量：1 L）：稱取1 g AgNO3，置于1 L燒杯中；加入約800 ml超純水， ；加超純水將溶液定容至1 L；棕色瓶室溫保存。顯色液（組份濃度：2% (W/V) NaOH，0.04% (W/V) Na2CO3，0.4% (W/V) 37%甲醛；配制量：1 L）：稱取20 g NaOH，0.4 g Na2CO3，置于1 L燒杯中；加入約800 ml超純水，充分攪拌溶解；加4 ml 37%甲醛溶液，加超純水將溶液定容至1 L；室溫保存。10% 冰乙酸（組份濃度：10% 冰乙酸；配制量：1 L）：量取100 ml冰乙酸，置于1 L燒杯中；加入約800 ml超純水，攪拌混勻；加超純水將溶液定容至1 L；室溫保存。2.2.6 電泳檢測2.2.6.1 玻璃板清洗首先用去污粉將電泳用玻璃板、膠墊、梳子等反復清洗；然后用級蒸餾水漂洗23次，直至玻璃板表面出現均勻水膜，既不聚成水滴，也不成股流下；再用超純水漂洗1次，晾干；最后用無水乙醇擦拭，晾干備用74。2.2.6.2 緩沖液貯液和凝膠母液的制備緩沖液貯液用5TBE，具體配制方法見2.1.2.2，用時稀釋5倍。凝膠母液用30%丙烯酰胺，具體配制方法見2.1.2.2。2.2.6.3 聚丙烯酰胺凝膠的制備10% 非變性聚丙烯酰胺凝膠（兩塊，約55 ml）各組分用量如下58：30% 丙烯酰胺：18 ml5TBE：11 ml超純水：25 mlTEMED：36 ml10% 過硫酸銨：385 ml具體操作步驟如下75：首先，按要求組裝好垂直電泳板，兩塊玻璃板的底部用1.5% 瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而導致聚丙烯酰胺膠液漏出。然后，灌膠。分別量取配比用量的30% 丙烯酰胺、5TBE和超純水置于100 ml燒杯中，用玻璃棒攪拌混勻；然后用微量加樣器加入配比用量的10% 過硫酸銨和TEMED，加入后聚合即開始，迅速搖勻；立即用玻璃棒引流，將混合液灌注于兩塊玻璃板之間，灌膠過程一次性完成，避免產生氣泡；灌膠完成后，一次性平穩(wěn)插入樣梳以形成點樣孔。最后，待聚合完全后往電泳槽中加入1TBE緩沖液直至沒過點樣孔，且正負極槽內緩沖液高度應一致。聚合時間一般在3060 min左右，凝膠聚合完全的標志是點樣孔附近形成清晰的界面，輕輕拔去樣梳，避免破壞點樣孔，并立即用電泳緩沖液沖洗點樣孔，以清除點樣孔中的氣泡和未凝固完全的膠液。2.2.6.4 電泳取PCR擴增產物5 ml與1 ml上樣緩沖液混合均勻后點入點樣孔，用10% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以20 bp DNA ladder（Takara）作為分子量標準，緩沖液為1TBE。接通電源，恒壓180200 V，電泳810 h，直至溴酚藍距離凝膠邊緣約1 cm時，停止電泳。2.2.6.5 銀染、顯色具體步驟如下76-78：（1）卸下玻璃板，用塑料薄片撬去上面一塊玻璃板，并小心除去下方的瓊脂糖凝膠；然后將附有聚丙烯酰胺凝膠的玻璃板以凝膠面朝下浸入盛有約200 ml超純水的玻璃器皿中，凝膠即脫落于水中，輕輕搖晃15 sec，倒掉液體；（2）加入約200 ml 0.1% AgNO3，置于搖床之上，以輕搖20 min左右，倒掉液體；（3）加入約200 ml超純水，輕搖15 sec，倒掉液體；（4）加入約200 ml顯色液，輕搖510 min，直至出現清晰帶型，倒掉液體；（5）加入約200 ml超純水，輕搖15 sec，倒掉液體；（6）加入約200 ml 10% 冰乙酸，固定；（7）用Bio-Rad紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察，照相以記錄電泳結果。1.4.3 聚丙烯酰胺凝膠改進的銀染方法(1) 電泳結束后切斷電源, 從電泳槽中倒出緩沖液, 然后取下膠板, 將凝膠從玻板中取出放入裝有蒸餾水的瓷盤中, 用蒸餾水漂洗2 次。(2) 銀染: 加入染色液(0.2%的AgNO3、1%的冰醋酸、1