生物實驗3PCR擴增 實驗報告.doc

實驗三 PCR擴增姓名：李宗翰 專業(yè)：環(huán)境工程 學號：1432999 同組人姓名：劉雪飛一、實驗目的復習PCR擴增的原理，熟悉PCR的操作流程。二、實驗原理 PCR，即聚合酶鏈式反應，是一項在體外、短時間內大量擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。以單鏈DNA為模板、4種dNTP為底物，在模板3末端有引物存在的情況下，用酶進行互補鏈的延伸。多次反復的循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴增。PCR包括三個過程：（1）、變性：目的雙鏈DNA片段在94下解鏈；（2）、退火：兩種寡核苷酸引物在適當溫度(5060)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；（3）、延伸：DNA模板引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。 重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 2-3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 三、實驗儀器及材料PCR擴增儀，微量移液器（0.12.5L、0.510L、10100L三種），Tip頭，0.2ml薄壁管，1.5ml離心管，Taq DNA 聚合酶，dNTP，buffer，引物（341FGC和534r），16S全長DNA樣本。四、實驗步驟1、用微量移液器分別取194LddH2O、25L Buffe、10L dNTP、5L 341FGC引物、5L 534r引物及12.5L Taq DNA聚合酶于1.5ml離心管中，混合均勻后分裝到9個0.2ml薄壁管中，每支管加入24L混合液。2、向第18支薄壁管分別加入1L樣品模板，第9支管加入1L無菌水做陰性對照。在薄壁管的蓋子上寫上組號及樣品編號。3、將9支薄壁管放入PCR擴增儀中，設置好擴增條件：94 3min；94 30s；55 30s；72 30s；72 5min；15。循環(huán)次數(shù)3040。設置好后啟動擴增儀，開始擴增。4、將擴增的好的樣品按下述步驟進行電泳實驗：（1）、取0.2g瓊脂糖和20ml 0.5TAE于錐形瓶中，放置微波爐中加熱2min左右，至混合液透明，取出室溫下冷卻。將混合液倒入FR-180E制膠器的槽中，插入孔刷，注意不要有氣泡。冷卻一段時間，等膠凝固。（2）、取10L Loading Buffer染液，在鋪平的塑料手套上均勻分成9份，再取4L PCR產物與染液混勻。將10L移液器調至6-7L，依次吸取上述混合液滴，分別加入到1-9號膠孔中，第10號膠孔中加入4L的DL 2000 TM DNA Maeker。（3）、將膠整個放入裝滿0.5TAE的電泳槽中，通100V電壓。（4）、電泳半小時左右，可明顯看出染液移動。將膠至于分析儀器內，在紫外燈照射下，得到電泳圖并拍照。五、實驗結果與討論1、此次實驗結果是什么？（請附圖）所得到的實驗結果該如何解釋？答：此次實驗結果如下圖所示。圖中，1-8號為待測樣品，9號為陰性對照，10號為DNA Marker。從電泳結果可以看出，3-6號樣品對應Marker的250bp左右處有明顯的亮帶，說明3-6號樣品的PCR擴張很好。2號樣品在250bp處條帶較微弱，說明擴增效果不是很好。而1、7、8號樣品，在250bp左右基本無亮帶，說明擴增實驗出錯，可能是因為模板沒取到或者移液器槍頭在加樣時未深入液面下加入而引起的。9號為陰性對照，在250bp處無亮帶，說明效果良好，實驗過程中無環(huán)境（ddH2O）污染。2、實驗過程中需要注意些什么細節(jié)？答：（1）、無菌盒內的離心管和薄壁管應用帶槍頭的微量移液器挑出，防止污染盒內其他管。（2）、配制反應體系時，由于不同樣品除了模板不同，其余試劑的加入量均相同，所以可以先在離心管中配制總體系（除模板DNA外的其他試劑均加好），混勻分裝到薄壁管后，再向個管內加模板DNA。這種方法比較節(jié)約時間。（3）、上述方法配制總體系時，應考慮取樣損失及誤差，多配一些（如8個樣品，1個陰性對照，可以按10個樣品的量配制）。（4）、用微量移液器移取液體時，由于移液量很少，所以每次應將槍頭插至管底將液體打出。（5）、PCR儀存在邊緣效應，即樣品板的周圍即角落處受熱較差，中間區(qū)域受熱較好，所以當樣品數(shù)目不多時，盡量放在樣品板中間區(qū)域。3、通過這個實驗你有什么收獲？答：通過PCR擴增實驗，我對PCR擴增理論有了更深入的認識，而且學到了配制反應體系時的很多細節(jié)。同時，我還學會了PCR擴增儀的參數(shù)設置及使用，通過老師的講解，我還了解了PCR擴增儀的一些特殊模式，如touch down以及分塊設置退火溫度等。六、思考題1、如果你的研究中要擴增大腸桿菌某個酶的基因，你如何進行相關實驗？（提示NCBI有大腸桿菌全基因組序列）答：（1）、現(xiàn)在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到大腸桿菌的全基因序列；（2）、從全基因序列中找到需要擴增的那個酶的基因片段；（3）、通過引物設計軟件來設計PCR擴增所需的引物；（4）、得到目的基因和引物后，通過常規(guī)PCR擴增實驗來進行擴增。（5）、擴增后結果可以通過電泳實驗進行分析。2、一對引物序列為5-GCACTCCAGTCGACTCTACA-3和5-ACCAGTGTCGACACCGCTCA請計算它們的Tm值及選擇合適的退火溫度，如果按你算的退火溫度做PCR時沒有得到相應的產物，你怎么解決？答：對于引物序列5-GCACTCCAGTCGACTCTACA-3，Tm1=4（G+C） 2（A+T）=4*（3+8）+2*（5+4）=62對于引物序列5-ACCAGTGTCGACACCGCTCA，Tm2=4（G+C） 2（A+T）=4*（4+8）+2