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動(dòng)物微生物及免疫學(xué)(實(shí)踐教學(xué)) 開(kāi)題報(bào)告 病豬肝臟中大腸桿菌與沙門氏桿菌的分離鑒定 班 級(jí)： 動(dòng)物醫(yī)學(xué)2009-1 聯(lián)系方式： 1528352XXXX 指導(dǎo)教師： XXX 時(shí) 間： 2011-6-20 動(dòng)物微生物及免疫學(xué)(實(shí)踐教學(xué)) 開(kāi)題報(bào)告組長(zhǎng)XXX成員XXX XXX班級(jí)動(dòng)醫(yī)2009-1課題名稱病豬肝臟中大腸桿菌與沙門氏桿菌的分離鑒定聯(lián)系電話1528352XXXX電子郵箱XXXXXXXXXXXX163.com立題依據(jù)大腸桿菌（E.coli）和沙門氏菌(Salmonella)同屬腸桿菌科，分別為埃希氏菌屬和沙門氏菌屬的代表菌。大腸桿菌為革蘭氏陰性的直桿菌，兩端成對(duì)，散在或成對(duì)，大多數(shù)以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。堿性染料對(duì)本菌有良好的染色，菌體兩端偶爾略深染。兼性厭氧。在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24h后，形成圓形凸起、光滑、潤(rùn)濕、半透明、灰白色菌落;麥康凱瓊脂上形成紅色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上產(chǎn)生黑色帶金屬閃光的菌落在SS瓊脂上一般不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)較差，生長(zhǎng)著呈紅色。本菌能夠發(fā)酵多重碳酸化合物產(chǎn)酸產(chǎn)氣。大多數(shù)菌能夠迅速發(fā)酵乳糖。大腸桿菌可分為致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌兩類。其血清型比較多：而沙門氏菌作為一種重要的生化特性和抗原結(jié)構(gòu)相似的人畜共患的腸道病原菌。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2523個(gè)血清型。沙門氏菌革蘭氏陰性，兼性厭氧。通常都以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。絕大多數(shù)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。在三塘鐵（TSI）上產(chǎn)生硫化氫。在腸道桿菌選擇或鑒別培養(yǎng)基上，大多數(shù)菌因?yàn)椴话l(fā)酵乳糖而呈無(wú)色菌落。麥康凱瓊脂上典型菌落呈透明、無(wú)色，有時(shí)帶有暗色中心。絕大多數(shù)沙門氏菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，能引起人和動(dòng)物多種臨床表現(xiàn)的沙門氏菌病，并未人類食物中毒的主要病原之一。根據(jù)兩種菌在腸道桿菌分離鑒定培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征，本次實(shí)驗(yàn)我們將以病豬肝為菌源設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者進(jìn)行分離培養(yǎng)，再利用生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟∝i肝中的大腸桿菌和沙門氏桿菌的分離培養(yǎng)及鑒定實(shí)驗(yàn)用品一、器械：顯微鏡，載玻片，擦鏡紙，高壓蒸汽滅菌器，恒溫箱，電爐，天平，酒精燈，量筒，燒杯，玻璃棒，三角瓶，漏斗，培養(yǎng)皿，試管，接種環(huán)，膠頭滴管，PH試紙，紗布，試管塞，扎繩，火柴，吸水紙，無(wú)菌操作臺(tái)等。二、藥品材料：病豬肝臟，各種培養(yǎng)基制備所需化學(xué)藥品，革蘭氏染色化學(xué)藥品，顯微鏡油鏡用油和擦鏡的二甲苯試液三、培養(yǎng)基及制備1、普通瓊脂培養(yǎng)基的制備稱取：牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂20g，蛋白胨10g，蒸餾水1000ml稱重，加熱煮沸，補(bǔ)水，調(diào)節(jié)PH值7.47.6，分裝入三角瓶包裝，滅菌。待適宜溫度（5060）后，倒入平皿，每平皿1015ml，將皿蓋蓋上。并將培養(yǎng)皿于桌面上輕輕旋轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基平鋪于皿底，制成普通瓊脂平板。2、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的制備稱取：NaCl 0.5g，瓊脂2.53.0g，蛋白胨2g，乳糖1g，膽鹽0.5g，1%中性紅水溶液0.5ml，蒸餾水1000。除中性紅水溶液外，其余各成分混合于鍋內(nèi)加熱溶解，調(diào)節(jié)PH7.07.2，煮沸，以脫脂棉花過(guò)濾。加入中性紅水溶液搖勻。121滅菌15min，待冷卻50時(shí)，傾成平板。等平板內(nèi)培養(yǎng)基充分凝固后，置溫箱內(nèi)烘干表面水分。實(shí)驗(yàn)用品1g，氯化鈉5g，硫代硫酸鈉0.3g，瓊脂12g，0.4%酚紅水溶液6.3ml，水1000ml。以上成分置于水中煮沸溶解，調(diào)節(jié)PH7.4，分裝直徑15mm的試管，每管10ml，在121中滅菌10min.趁熱做成底層部分約2.5cm高的高層斜面3、三糖鐵培養(yǎng)基的制備稱取牛肉浸膏3g，蛋白胨20g，枸櫞酸鐵0.3g，乳糖10g，蔗糖10g，酵母膏3g，葡萄糖1g，氯化鈉5g，硫代硫酸鈉0.3g，瓊脂12g，0.4%酚紅水溶液6.3ml，水1000ml。以上成分置于水中煮沸溶解，調(diào)節(jié)PH7.4，分裝直徑15mm的試管，每管10ml，在121中滅菌10min.趁熱做成底層部分約2.5cm高的高層斜面。4、尿素瓊脂培養(yǎng)基制備基礎(chǔ)成分：蛋白胨 1g、氯化鈉 5g、葡萄糖 1g、磷酸二氫鉀2g、酚紅溶液0.012g、瓊脂15g、蒸餾水900ml濃尿素：尿素20g、蒸餾水100ml、調(diào)整pH值至6.86.9。過(guò)濾除菌方法：溶解15g瓊脂與水內(nèi)，加入其他成分，121高壓滅菌15分鐘。冷至5060，再加100ml濃尿素。混勻后，分裝滅菌試管內(nèi)。培養(yǎng)基做成斜面或高層。方法和步驟1、肝組織取樣,然后用小刀在組織上劃一小口2、將接種環(huán)伸入肝組織小口內(nèi)接觸取樣，再接種到兩個(gè)麥康凱平板，37培養(yǎng)24h。3、疑似菌落篩選：分A、B兩組培養(yǎng)1)A組準(zhǔn)備三糖鐵和普通瓊脂斜面，分別挑去疑似大腸桿菌菌落3-5個(gè)接種，37培養(yǎng)24h。；2)B組準(zhǔn)備三糖鐵、尿素瓊脂及普通瓊脂斜面，分別接種疑似沙門氏菌，37培養(yǎng)24h。注意：接種的菌落幾個(gè)培養(yǎng)基要一一對(duì)應(yīng)并標(biāo)記，保證后續(xù)試驗(yàn)順利進(jìn)行。TSI預(yù)期結(jié)果：斜面底層產(chǎn)氣硫化氫沙門氏菌-+/-+大腸桿菌+/-4、初步鑒定：A組中，對(duì)符合大腸桿菌TSI菌落特征的細(xì)菌制片G染色，鏡檢。不符合者停止鑒定；B組中，對(duì)符合沙門氏菌TSI菌落特征和尿素分解陰性的細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)鑒定。不符合者停止鑒定。5、生化實(shí)驗(yàn)：取A、B組中合格菌對(duì)應(yīng)的普通瓊脂平板上的細(xì)菌進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，每種生化發(fā)酵管均37培養(yǎng)24h，然后觀察記錄結(jié)果。注：生化實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果葡萄糖乳糖蔗糖麥芽糖甘露醇肌醇MRVPC尿素硫化氫大腸桿菌黃色氣柱黃色氣柱黃色或紫色黃色氣柱黃色紫色紅色黃色淡綠色黃色淡黃色沙門氏菌黃色氣柱紫色紫色黃色氣柱黃色黃色紅色黃色深藍(lán)色黃色黑色6、分析得出最終鑒定結(jié)果。注意事項(xiàng)1、嚴(yán)格遵守各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作，如無(wú)菌操作，以避免結(jié)果的偏差； 2、最好按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃準(zhǔn)時(shí)操作，或有所推遲，以確保每次培養(yǎng)都能達(dá)到規(guī)定時(shí)間，如24h；3、操作人員應(yīng)注意安全。如酒精使用燈、有毒藥物使用的安全； 4、實(shí)驗(yàn)前后應(yīng)注重個(gè)人衛(wèi)生，穿實(shí)驗(yàn)服、實(shí)驗(yàn)后吸收等，避免有毒菌感染；5、每日操作及觀察結(jié)