乳腺生物反應(yīng)器.ppt

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器 2020 4 15 1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù) 加快家畜品種的改良速度 提高肉 奶 蛋的產(chǎn)量和品質(zhì) 生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白 為大量患者造福 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最誘人的前景是作為生物反應(yīng)器 利用它生產(chǎn)人類(lèi)所需要的生物活性產(chǎn)品或藥物 其常用方法是把目的基因在血液循環(huán)系統(tǒng) 唾液腺或乳腺等器官或組織中表達(dá) 從而獲得人類(lèi)需要的目的產(chǎn)物 根據(jù)目的蛋白表達(dá)部位的不同可分為乳腺生物反應(yīng)器 血液生物反應(yīng)器 卵生物反應(yīng)器 尿生物反應(yīng)器 精囊腺生物反應(yīng)器 唾液腺生物反應(yīng)器等 2020 4 15 2 乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟 乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展 乳腺生物反應(yīng)器的存在的問(wèn)題 乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用 2020 4 15 3 原理 應(yīng)用重組DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù) 將目的基因轉(zhuǎn)移到尚處于原核階段的動(dòng)物胚胎中 經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)多肽藥物 工業(yè)酶 疫苗和抗體等蛋白的技術(shù) 外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個(gè)啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū) 即需要一個(gè)引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列 這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制之下 使其在乳腺中表達(dá)再通過(guò)回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白 乳腺生物反應(yīng)器的原理及步驟 2020 4 15 4 步驟 2020 4 15 5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素 EPO 將EPODNA分別以Hind 和BamHI酶切 回收5 4kb的Hind BamHI片段 插入pGEM 7zf 載體 再將867bp的BLG啟動(dòng)子插入EPO基因之前EcoR ClaI位點(diǎn) 構(gòu)建表達(dá)載體pGEM 3zf LG EPO 通過(guò)顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠 其乳腺中的EPO含量可達(dá)0 5 g ml 2020 4 15 6 20世紀(jì)80年代末提出動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的設(shè)想1987年 Gordon等首次報(bào)道在小鼠的乳腺中表達(dá)了人的組織纖溶酶原激活劑 tPA 基因 1991年 WrightG等培育成乳腺特異表達(dá)人抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因綿羊 表達(dá)水平高達(dá)35g L 在世界范圍內(nèi)引起了極大的轟動(dòng) 1991年 Brem等報(bào)道乳腺表達(dá)牛凝乳酶的轉(zhuǎn)基因兔 表達(dá)水平達(dá)到1 10g L 1992年 Ve lande 等報(bào)道了乳腺表達(dá)人C蛋白的轉(zhuǎn)基因豬 表達(dá)水平達(dá)到1g L以上 目前 從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶 抗凝血酶 和人C蛋白等基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段 并已初步形成以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺為主要生產(chǎn)手段的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè) 乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展 國(guó)外研究進(jìn)展 2020 4 15 7 20世紀(jì)80年代初 施履吉院士就提出乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)想 并成功獲得表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔 為我國(guó)通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的途徑獲得珍貴藥物奠定了基礎(chǔ) 1995年 我國(guó)首次在小鼠乳腺中成功地表達(dá)了人的基因 1996年10月上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所與復(fù)旦大學(xué)合作研制成功的能在乳腺中表達(dá)人凝血因子 的轉(zhuǎn)基因羊 2005年 國(guó)家 863 計(jì)劃組利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù) 分別獲得了轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白 轉(zhuǎn)人溶菌酶 轉(zhuǎn)乳清白蛋白等轉(zhuǎn)人基因蛋白 其中人乳鐵蛋白和人 乳清白蛋白是國(guó)際上首次利用轉(zhuǎn)基因克隆牛而獲得的 雖然我國(guó)在該項(xiàng)技術(shù)上取得了較大進(jìn)展 但還處于探索階段 與國(guó)外還有一定的差距 自國(guó)家 863 計(jì)劃對(duì) 動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器應(yīng)用研究 立項(xiàng)后 逐步受到有關(guān)部門(mén)和企業(yè)界的重視 研究和開(kāi)發(fā)的力度加強(qiáng) 前景非常樂(lè)觀 國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展 2020 4 15 8 表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性利用DNA重組技術(shù)的微生物來(lái)生產(chǎn)的藥用蛋白 由于細(xì)菌等微生物不能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成后的加工 因而生物活性低 并且具有免疫原性 產(chǎn)品成本低 可以大規(guī)模生產(chǎn)藥物其效率是利用以大腸桿菌和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的100倍產(chǎn)品質(zhì)量高 易提純生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣 極易提純 乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及其應(yīng)用 2020 4 15 9 應(yīng)用 組織纖溶酶原激活劑 TPA 由美國(guó)遺傳技術(shù)公司開(kāi)發(fā)的血栓溶解劑 1987年11月經(jīng)聯(lián)邦食品及藥物管理局 FDA 批準(zhǔn)上市 1988年的銷(xiāo)售額為1 5 1 6億美元 1989年為1 8 1 9億美元 今后每年的市場(chǎng)銷(xiāo)售額約為2 2 5億美元 重組人抗凝血酶ii 世界上第一個(gè)動(dòng)物乳腺生物反映器重組蛋白藥物 重組人抗凝血酶iii具有抑制血液中凝血酶活性 預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成 對(duì)治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果 2010年 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷(xiāo)售額達(dá)到350億美元 生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物種類(lèi)的90 以上 2020 4 15 10 目的基因在動(dòng)物基因中的整合問(wèn)題 由于目的基因在動(dòng)物基因中的整合是隨機(jī)的 因此包括整合位點(diǎn) 整合的拷貝數(shù)等機(jī)制還不清楚 所以易發(fā)生調(diào)節(jié)失控 遺傳不穩(wěn)定 表達(dá)率不高等問(wèn)題 乳腺生物反應(yīng)器的存在的問(wèn)題 2020 4 15 11 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成活率低 在目的基因的分離和改造 乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵性技術(shù)上存在缺陷 無(wú)法保證對(duì)基因的定點(diǎn)整合 因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物常會(huì)出現(xiàn)繁殖力下降 胚胎早期死亡等各種生理及病理缺陷 2020 4 15 12 安全性 動(dòng)物體內(nèi)雖然可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾 但由于牛 羊等家畜存在自身機(jī)體保護(hù)系統(tǒng)可對(duì)所有外源性物質(zhì)產(chǎn)生排斥反應(yīng) 如出現(xiàn)蛋白質(zhì)水解等問(wèn)題 此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對(duì)產(chǎn)品的安全性構(gòu)成了極大的威脅 所以在分離過(guò)程中要去除所有可能引起人類(lèi)變態(tài)反應(yīng)的蛋