藥用微生物學(xué)綜述

微生物生物轉(zhuǎn)化在藥物合成中的應(yīng)用摘要：微生物在藥物的合成開發(fā)中具有十分重要的作用，除了其次級代謝產(chǎn)物成為疾病的藥物來源外，微生物的酶在藥物合成中的應(yīng)用也越來越多，微生物的酶生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)溫和、立體選擇性強和效率高的優(yōu)點，已成功地應(yīng)用于甾體藥物和手性藥物的合成中，在某些中藥的開發(fā)中也有廣闊的前景。微生物對藥物合成的貢獻越來越大，仍然具有更深的潛力。關(guān)鍵詞：微生物； 生物轉(zhuǎn)化； 甾體； 手性藥物 The Applications of Microbial Biotransformation in Pharmaceutical SynthesisAbstract：Microorganisms play a very important role in the development of synthetic drugs. In addition to their secondary metabolites as a new medicine source, the application of microbial enzymes in drug synthesis is also increasing. The microbial transformation has been successfully applied to the synthesis of the steroid drugs and chiral drugs, and has broad prospects in the development of Traditional Chinese Medicines because of the advantages of mild reaction, stereo selectivity and high efficiency. Microorganisms make a bigger and bigger contribution to drug synthesis, and still have a greater potential.Key Words: Microorganism; Transformation; Steroid; Chiral drugs微生物生物轉(zhuǎn)化是指利用生物體系，如細胞和酶等作為催化劑，實施有機合成目的的合成方法，具有傳統(tǒng)化學(xué)合成不可比擬的優(yōu)點，如選擇性好、催化效率高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等。微生物轉(zhuǎn)化提供了許多常規(guī)化學(xué)方法不能或不易完成的合成方法1?，F(xiàn)代生物轉(zhuǎn)化研究一般認為始于巴斯德時代，但工業(yè)化生物轉(zhuǎn)化最重要的里程碑應(yīng)該是二十世紀 50 年代利用微生物對甾體化合物的結(jié)構(gòu)改造。此后，一些重要生物技術(shù)的發(fā)展導(dǎo)致了有些傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)工藝被由生物催化劑催化的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)所代替，目前微生物生物轉(zhuǎn)化已在復(fù)雜分子藥物（典型如甾體藥物）的合成或半合成、手性藥物拆分或不對稱合成以及中藥現(xiàn)代化合成等方面有了較為成功的巨大發(fā)展，大大簡化了生產(chǎn)路線，降低了成本。微生物轉(zhuǎn)化與復(fù)雜分子藥物合成分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的藥物，如甾體藥物等，依靠傳統(tǒng)的化學(xué)工藝進行合成，不僅合成路線復(fù)雜，一些特殊位點上的反應(yīng)也難以進行，如甾體C11位羥化反應(yīng)，化學(xué)法很難進行，而采取微生物轉(zhuǎn)化法則比較容易。1.1 甾體藥物的微生物合成甾體藥物的微生物合成是微生物轉(zhuǎn)化法在醫(yī)藥合成領(lǐng)域的一大重要成功典范，促進了甾體合成藥物的發(fā)展。目前對甾體激素類藥物的合成比較重要的反應(yīng)有氧化反應(yīng)（主要為甾體骨架上的羥基化反應(yīng)）、還原反應(yīng)和水解反應(yīng)。實驗室主要研究2個甾體藥物的羥化反應(yīng)：去氫表雄酮的C7和C15位羥基化和坎利酮的C15和C11位羥基化反應(yīng)1。表1為常見催化甾體羥基化的微生物。1.1.1 去氫表雄酮的雙羥化反應(yīng)Peart2等人利用尖孢鐮孢變種病菌UAMH 9013對去氫表雄酮等11個底物進行培養(yǎng)，通過雄甾烷-3，17 -二酮、雄甾烷-4,6-二烯-3,17-二酮和3,5-cycloandrost-6-en-17-one對結(jié)果進行探討，證明了可能存在的C7和C15羥化酶。Hu, Haifeng3等人通過利用炭疽菌（Colletotrichum lini (AS 3.4486)）對去氫表雄酮底物進行生物轉(zhuǎn)化，合成了7, 15-二羥基雄烯醇酮。實驗結(jié)果表明，該方法的產(chǎn)率約為90%，去氫表雄酮的轉(zhuǎn)化率可達到75%。1.1.2 坎利酮的生物轉(zhuǎn)化通過對坎利酮進行結(jié)構(gòu)修飾可得到臨床治療心血管疾病的藥物Eplerenone，其中的C11羥化反應(yīng)可經(jīng)過微生物轉(zhuǎn)化來完成。為了獲得其新的結(jié)構(gòu)衍生物，人們通過赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）羥化酶轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對坎利酮進行轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)了不同的酶系轉(zhuǎn)化形成多個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，包括15-羥基坎利酮、11-羥基坎利酮和11-羥基-6,7-二氫坎利酮等化合物4。Bie, Songtao5等人利用赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）對底物坎利酮進行生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，使得坎利酮轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵中間體11-羥基坎利酮，最終獲得了很高的轉(zhuǎn)化率。1.1.3 甾醇側(cè)鏈的降解6微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體雄-4-烯-3, 17-二酮 ( 4-AD) 和雄甾-1, 4-二烯-3, 17-二酮 ( ADD) 對于我國制藥行業(yè) 具有重要意義。對 4-AD和 ADD的活性部位進行結(jié)構(gòu)改造, 可以合成出多種甾體藥物。微生物對甾醇作用產(chǎn)生 4-AD 和 ADD主要包括側(cè)鏈的降解, C-3位羥基氧化成酮基以及 C-5, 6位雙鍵的氫化。其中, 起決定作用的是側(cè)鏈的降解。甾醇側(cè)鏈的降解開始于 C-27位的羥化, 然后經(jīng)過氧化, 最終截斷于 C-17位。選擇性控制微生物降解側(cè)鏈的途徑主要有以下兩種: 加入酶抑制劑以及利用誘變技術(shù)。諾卡氏菌、分枝桿菌、節(jié)桿菌和假單胞桿菌等微生物都能將甾醇類化合物作為碳源利用, 而使甾醇降解。其中分枝桿菌應(yīng)用最為廣泛。1.2 其余復(fù)雜藥物的合成除甾體藥物外，一些分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，難以通過化學(xué)法全合成的中藥，如青蒿素，也可通過微生物轉(zhuǎn)化來合成。青蒿素是我國從中藥中自主開發(fā)的抗瘧藥物，許多科研工作者都試圖通過結(jié)構(gòu)改造，以提高青蒿素的資源利用率。迄今已制備了數(shù)百個青蒿素的衍生物，并篩選出雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿虎酯及青蒿酯鈉等幾個高效抗瘧衍生物，但是由于青蒿素的有效活性基團過氧橋的不穩(wěn)定性，使得對青蒿素結(jié)構(gòu)改造無法在酮基以外的部位進行，目前可用的化學(xué)改造方法都停留在對酮基的還原及對羥基的取代反應(yīng)上。1 Chris7等人依次利用改造篩選過的高產(chǎn)大腸桿菌（Escherichia coli，25g/L）和酵母（Saccharomyces cerevisiae，40g/L）發(fā)酵來半合成青蒿素，通過大腸桿菌合成中間體紫穗槐二烯，然后轉(zhuǎn)移到酵母中發(fā)酵，最后進行簡單地化學(xué)修飾，得到抗瘧疾藥青蒿素。下圖為主要合成流程。C. J. Paddon8等人利用基因修飾的酵母菌進行發(fā)酵生產(chǎn)青蒿素，得到高水平產(chǎn)率的產(chǎn)物，為青蒿素的工業(yè)化擴大生產(chǎn)提供了新的途徑。微生物轉(zhuǎn)化與手性藥物合成在自然狀態(tài)下, 手性藥物的兩種形態(tài)雖然化學(xué)組成一樣, 但它們各自的毒性、生理活性和藥理作用往往存在著差別。合成手性藥物的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)大致可分為兩類：一類是把外消旋體拆分為兩個光活性的對映體；另一類是從外消旋或前手性的前體出發(fā)，通過催化反應(yīng)得到不對稱的光活性產(chǎn)物9。通過微生物酶催化不對稱合成反應(yīng)或拆分外消旋體合成醫(yī)藥手性中間體具有獨特的優(yōu)勢。常用的微生物酶主要為脂肪酶，典型的包括細菌脂肪酶，如來自綠膿桿菌(P. aeruginosa)、熒光假單胞桿菌(P. fluorescens)、假單胞菌(Pseudomonas)、洋蔥伯克氏菌(B. cepacia)、染色粘性菌(C. viscosum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等以及來自真菌的南極假絲酵母(C.antarctica B)和皺褶假絲酵母(C. rugosa)的脂肪酶，在這方面已有大量的報道10。2.1 手性藥物的外消旋體拆分通過微生物酶選擇性拆分（Enantioselective resolution）外消旋體得到手性藥物，就是利用生物酶或含有活性酶的微生物菌體作為生物催化劑，將其中一個對映體進行選擇性轉(zhuǎn)化，達到外消旋體拆分的目的。微生物酶選擇性拆分反應(yīng)具有高度的立體專一性，副反應(yīng)小，產(chǎn)率高，產(chǎn)品分離提純簡單，產(chǎn)物光學(xué)純度很高，而且反應(yīng)過程大多在溫和的條件下進行，可以彌補化學(xué)拆分法拆分消旋體的許多不足11。Yousefi12等人利用固定在辛基瓊脂糖凝膠上的皺褶念珠菌脂肪酶（CRL）和米根霉脂肪酶（ROL）對水解后外消旋的布洛芬酯進行手性拆分，可明顯地分離出S-（+）-布洛芬（ee值95%），也證明了微生物酶手性拆分的可行性。酶法拆分外消旋體在實驗室制備和工業(yè)生產(chǎn)中都已取得長足的進步，但是仍然有其局限性。比如菌種篩選困難、酶制劑不易保存、產(chǎn)物后處理工作量大，以及通常只能得到一種對映體等缺點。盡管如此，利用微生物進行手性藥物的合成及對映體的拆分仍是當(dāng)前研究熱點13。2.2 手性藥物的不對稱催化合成微生物酶催化不對稱合成（Asymmetric synthesis）是指一個有機反應(yīng)，其中底物分子整體中的非手性單元由反應(yīng)劑以不等量地生成立體異構(gòu)產(chǎn)物的途徑轉(zhuǎn)化為手性單元。應(yīng)用生物催化轉(zhuǎn)化技術(shù)進行不對稱合成與化學(xué)合成法相比較具有的優(yōu)越性9有：轉(zhuǎn)化底物某一基團的專一性強，即對不需要轉(zhuǎn)化的基團無需保護；通過對用于某一轉(zhuǎn)化的微生物進行菌種選育和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，可以得到極高的轉(zhuǎn)化率；生物催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件溫和對環(huán)境的污染很小。趙秋堂14比較了5種不同的R-沙美特羅的合成方法，其中以深紅酵母（Rhodotorula rubra）為催化劑不對稱合成R-構(gòu)型的環(huán)氧化合物，進一步得到目標分子。它利用了酶促反應(yīng)的高立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性將化學(xué)合成的外消旋體、前體或潛手性化合物轉(zhuǎn)化為單一光學(xué)活性產(chǎn)物。但該法對化學(xué)和熱不穩(wěn)定、與有機溶劑不相溶等因素造成其難以推廣使用。其合成路線如下：近年來人們越來越多地篩選得到可降解有機鹵化物的微生物，并從中分離得到鹵醇脫鹵酶，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)鹵醇脫鹵酶不但可以催化碳鹵鍵的斷裂進行脫鹵反應(yīng)，而且可以高選擇性地催化接受除鹵離子外的一系列非自然親核試劑，如N3、NO2、CN等所介導(dǎo)的環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)，用以生成一系列光學(xué)純的-取代醇。因此，鹵醇脫鹵酶在手性藥物合成方面的應(yīng)用備受矚目15。微生物是我們重要的醫(yī)藥資源之一，目前微生物已在醫(yī)藥合成領(lǐng)域取得了不錯的成就，在一些復(fù)雜藥物或手性藥物的合成上具有巨大的優(yōu)勢與特點，可以大大地簡化生產(chǎn)流程，降低生產(chǎn)成本，但是，微生物轉(zhuǎn)化在醫(yī)藥合成中也存在副產(chǎn)物分離復(fù)雜、對某些反應(yīng)條件不適應(yīng)等問題。然而，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展，我們對微生物的進一步認識，必定會促進藥物研究的快速發(fā)展。References: 1.胡海峰與朱寶泉, 微生物在藥物開發(fā)中的應(yīng)用. 中國天然藥物, 2006(03): 第168-171頁. 2.Peart, P.C., et al., Hydroxylation of steroids by Fusarium oxysporum, Exophiala jeanselmei and Ceratocystis paradoxa. 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