劉健-生物燃料中嗜酸耐熱蛋白的研究-生物化學(xué)與分子生物學(xué).ppt

生物燃料中嗜酸耐熱蛋白的研究 MatthiasHess 劉健2009 4 28 前言 由于對(duì)全球氣候改變和能源依賴問題的關(guān)注日益增長 導(dǎo)致更大的投入去減少碳的排放量 開發(fā)新的能源 有一個(gè)可行的辦法 那就是使用從木質(zhì)纖維素中提取的生物質(zhì)燃料去代替礦物燃料 木質(zhì)纖維素是由纖維素 半纖維素 木質(zhì)素和少量的可溶性固形物組成 纖維素大分子是由葡萄糖脫水 通過 1 4葡萄糖苷鍵連接而成的直鏈聚合體 在常溫下不發(fā)生水解 高溫下水解也很緩慢 只有在催化劑的作用下 纖維素的水解反應(yīng)才顯著進(jìn)行 從木質(zhì)纖維素中提取生物質(zhì)燃料的一個(gè)主要瓶頸就是高效廉價(jià)的能在高溫和低ph值下保持活性和穩(wěn)定的生物催化劑的可獲得性 比如 乙醇脫氫酶 纖維素酶和酯酶 盡管異源基因表達(dá)被有效地用來去獲得來源于嗜熱菌的重組蛋白 但這種嗜酸耐熱的蛋白成功的還是很少 生物催化劑 木質(zhì)纖維素的降解涉及很多個(gè)步驟和一個(gè)纖維素降解的化學(xué)過程 早在1883年有報(bào)道使用高濃度酸降解纖維素 1918年 多了一個(gè)用稀酸預(yù)處理的步驟 用來促進(jìn)半纖維素的去除 當(dāng)前在生物質(zhì)降解的工業(yè)化過程中需要高溫和酸性的條件 導(dǎo)致成本高并且低效 考慮到纖維素降解過程中對(duì)酸性高溫環(huán)境的依賴 可以清晰的看到 在低pH值和高溫下保持穩(wěn)定和活性的酶對(duì)生物質(zhì)燃料有特殊的價(jià)值 當(dāng)前 一些工業(yè)化相關(guān)的配糖類水解酶已經(jīng)從嗜酸耐熱的生物體中被識(shí)別 其中一些存在于廣古菌門 熱原體目中嗜酸的生物體 已經(jīng)涉及到最近對(duì)新生物催化劑的研究中 研究的結(jié)果識(shí)別和表征了幾種酶 很可能這些嗜酸耐熱的生物催化劑可以使纖維素與生物燃料的工業(yè)轉(zhuǎn)化更有效率 目前 面臨的主要挑戰(zhàn)是編碼酶基因的識(shí)別和和構(gòu)建合適的表達(dá)系統(tǒng) 重組蛋白合成中的障礙 外源基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建是困難的 設(shè)計(jì)一個(gè)能在真核細(xì)胞或細(xì)菌表達(dá)宿主中生產(chǎn)古細(xì)菌嗜酸耐熱蛋白的表達(dá)系統(tǒng)就更具有挑戰(zhàn)性 因?yàn)橛泻芏嘁蛩匾紤] 如 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集 酶無活性 甚至完全沒有基因表達(dá) 這些困難的原因是多方面的 包括mRNA的不穩(wěn)定 偏愛密碼子和缺乏合適的分子伴侶機(jī)制 由大量稀有密碼子編碼的古細(xì)菌蛋白質(zhì)在大腸桿菌中不善表達(dá) 并且它們的表達(dá)可能抑制表達(dá)宿主的生長 有時(shí)這種在外源基因表達(dá)中的困難可以通過提供與問題密碼子對(duì)應(yīng)的額外tRNA基因拷貝輕易地解決 這樣的宿主 大腸桿菌Rosetta DE3 或大腸桿菌BL21 CodonPlus 已經(jīng)可以從一些公司獲得 另一個(gè)問題是 這些表達(dá)菌株沒有蛋白酶Lon 因此更容易形成包含體 IBs 盡管做了大量的努力去避免無效蛋白聚集的形成 但獲得可溶性蛋白仍然是一個(gè)有待解決的問題 冷休克反應(yīng) 當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)從37度轉(zhuǎn)移至15度時(shí) 細(xì)胞生長停止 并且產(chǎn)生一套蛋白 定義為冷休克蛋白 CSPs 其中一些CSPs在降溫后的蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮了重要的作用 在大腸桿菌冷休克反應(yīng)中一個(gè)主要的成員是蛋白CspA 作為一個(gè)mRNA的分子伴侶發(fā)揮作用 在CspA基因的上游有一個(gè)相當(dāng)長的5 端非編碼區(qū)和一個(gè)翻譯增強(qiáng)子 包含CspA啟動(dòng)子 5 端非編碼區(qū) 翻譯增強(qiáng)子和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的3 端非編碼區(qū)在內(nèi)的質(zhì)粒被成功的用于溫度降低后重組蛋白的高表達(dá) 這些質(zhì)粒稱之為pCold載體 可以由Takara生物買到 它很可能是類似的表達(dá)載體 將會(huì)增加中溫生產(chǎn)菌株嗜酸耐熱蛋白的產(chǎn)量 熱休克反應(yīng) 和CSPs相反 熱休克蛋白 HSPs 是暴露在溫度升高后合成的蛋白 HSPs包括分子伴侶 ATP酶 蛋白酶和DNA修復(fù)蛋白 它們調(diào)節(jié)細(xì)胞在受到熱休克可能致死的條件下的生存 比如溫度升高 鹽或者乙醇濃度升高 或者pH值降低 通常情況下 三個(gè)主要類別的熱休克蛋白 Hsp100 Hsp90和Hsp83 在古細(xì)菌中是沒有的 而同源的Hsp70 也稱為DnaK Hsp40 DnaJ 和GrpE在高溫和中溫古細(xì)菌中出現(xiàn) 有人認(rèn)為 HSPs的減少或許是基因組要求的結(jié)果 表達(dá)系統(tǒng) 最近分析了嗜酸耐熱廣古生菌Picrophilustorridus 嗜酸熱原體和Thermoplasmavolcanium完整基因組 有趣的是 盡管這些基因組很緊密 但是在這些基因組中還是識(shí)別到了DnaK DnaJandGrpE的基因編碼 盡管超嗜熱細(xì)菌基因組沒有基因編碼DnaK DnaJ和GrpE 但是在嗜酸耐熱生物體更小的基因組顯示開放閱讀框來編碼這些HSPs的同源蛋白 這樣看起來很可能保留這組蛋白是進(jìn)化的優(yōu)勢 甚至是必要的 對(duì)那些在pH值低至0的生物體來說 這些發(fā)現(xiàn)表明 含有DnaK DnaJandGrpE的表達(dá)載體可以增加來自嗜溫菌 嗜熱菌 熱別是嗜酸耐熱菌重組蛋白的產(chǎn)量 DnaK或dnaK dnaJ grpE組的表達(dá)對(duì)一些在生理?xiàng)l件下來自熱原體生物自身蛋白的生產(chǎn)可能是必須的 而且 這些基因在大腸桿菌或其他表達(dá)宿主中的聯(lián)合表達(dá)可能是一種簡單但是有效的策略 以改善來自嗜酸耐熱生物體重組蛋白的活性和穩(wěn)定性 除了大腸桿菌 其他像酵母和釀酒酵母 硫化葉菌也具有表達(dá)古細(xì)菌基因的潛力 研究最好的是硫化菌 大部分關(guān)于地?zé)岘h(huán)境中分離出的古細(xì)菌的分子生物學(xué)和生理學(xué)的資料都是從研究硫化菌中獲得的 因此 基于部分熱原體和DnaK DnaJan