流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析.docx

流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析5.1 數(shù)據(jù)采集及顯示 光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電壓脈沖后，再通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成為計(jì)算機(jī)能夠儲(chǔ)存處理的數(shù)字信號(hào)。 流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標(biāo)準(zhǔn)格式存儲(chǔ)，該標(biāo)準(zhǔn)由“分析細(xì)胞學(xué)協(xié)會(huì)”制定。根據(jù)FSC標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)格式應(yīng)包括三個(gè)文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設(shè)置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。 4參數(shù)（FSC，SSC，F(xiàn)ITC和PE）的單細(xì)胞分析會(huì)生成8位數(shù)據(jù)。當(dāng)單個(gè)樣品累計(jì)收集到10000個(gè)細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)CS數(shù)據(jù)文件為80kB。 數(shù)據(jù)采集存儲(chǔ)完畢后，細(xì)胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數(shù)如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道?？v軸表示在該通道內(nèi)收集到的細(xì)胞數(shù)量（如圖5-1）。處在同一通道的每一細(xì)胞均符合該通道的信號(hào)值，而且具有相同的信號(hào)密度。通道右側(cè)信號(hào)的熒光強(qiáng)度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強(qiáng)。 圖5-1 流式數(shù)據(jù)分析圖雙參數(shù)可在二維散點(diǎn)圖中同時(shí)顯示，X軸顯示通道1（FL1），Y軸顯示通道2（FL2）。3維圖通過(guò)X，Y，Z三個(gè)軸分別顯示每個(gè)通道的細(xì)胞量（如圖5-1）。 習(xí)題：數(shù)據(jù)采集及顯示 1 在直方圖中橫軸和縱軸分別表示 。 2 二維點(diǎn)圖用于顯示 參數(shù)。 3 在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表 。5.2 設(shè)門 通過(guò)設(shè)門的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細(xì)胞亞群的熒光特性。 圖5-2 全血樣本中淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖 習(xí)題：設(shè)門 1 設(shè)門的方法通常用于分析樣本內(nèi)的指定細(xì)胞。（對(duì) 錯(cuò)）5.3 細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析包括從點(diǎn)圖中的list-mode文件中顯示數(shù)據(jù),然后統(tǒng)計(jì)點(diǎn)圖中的細(xì)胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點(diǎn)圖用于顯示數(shù)據(jù)，而且可通過(guò)設(shè)門的方法區(qū)分指定的細(xì)胞亞群。 如圖5-3所示，在淋巴細(xì)胞亞群周圍設(shè)門，以單獨(dú)分析或分選該亞群細(xì)胞。 圖5-3 選定淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門 門內(nèi)細(xì)胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。在下面的實(shí)例中，我們將詳盡闡述細(xì)胞亞群百分含量的不同分析方法。 我們可以通過(guò)單參數(shù)直方圖，二維點(diǎn)圖和三維圖來(lái)分析結(jié)果。單參數(shù)直方圖可定位邊界，二維點(diǎn)圖可設(shè)置象限標(biāo)志。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表以輸出結(jié)果。 直方圖可直觀單個(gè)參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰性對(duì)照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界（見圖5-4）。左圖中M1為陰性對(duì)照峰。右圖中M2為CD3 FITC陽(yáng)性峰。圖5-4 陰性對(duì)照峰M1（NORM001）和CD3 FITC陽(yáng)性峰M2（NORM002） 圖5-5的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，整個(gè)事件共記錄了6000個(gè)細(xì)胞，門內(nèi)淋巴細(xì)胞2891個(gè)。其中M1（陰性）細(xì)胞619個(gè)，M2（CD3陽(yáng)性）細(xì)胞2272個(gè)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群CD3陽(yáng)性百分含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%。 圖5-5 直方圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果 二維點(diǎn)圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。圖5-6為陰性對(duì)照?qǐng)D，用于設(shè)定陰性對(duì)照邊界，全圖劃分為四個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽(yáng)性細(xì)胞以及雙陽(yáng)性細(xì)胞。左下象限（LL）為雙陰性細(xì)胞，左上象限（UL）為Y軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD19 PE），左下象限（LR）為X軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD3 FITC），右上象限（UR）為雙陽(yáng)性細(xì)胞（CD19+/CD3+）。 圖5-6 陰性對(duì)照組(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE雙染樣本(NORM002) 如圖5-7所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽(yáng)性細(xì)胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43%。 圖5-7 散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果 另一個(gè)分析方法是劃定區(qū)域，也就是設(shè)門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域（如圖5-8所示）；然后統(tǒng)計(jì)該區(qū)域內(nèi)指定細(xì)胞亞群的百分含量。在圖5-9中，R4門內(nèi)為CD4陽(yáng)性，CD3陰性的淋巴細(xì)胞亞群，其結(jié)果為：40/2866=1.40%。圖5-8 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本分析圖 圖5-9 CD3 FITC/CD4 PE 雙染樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 這種方法在分析不同的供體細(xì)胞時(shí)存在一個(gè)缺陷，因?yàn)槿绻孪榷x好細(xì)胞亞群的區(qū)域或邊界，在隨后的文件中，下一個(gè)樣本的細(xì)胞亞群位置會(huì)發(fā)生變化，這就需要操作者重新調(diào)整區(qū)域或邊界位置。 為避免這種情況的發(fā)生，我們采用一種稱為集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM軟件就屬于集群分析軟件。該軟件的特點(diǎn)是會(huì)隨著整個(gè)細(xì)胞亞群的移動(dòng)而移動(dòng)，自動(dòng)變換區(qū)域或邊界到相應(yīng)的細(xì)胞亞群位置（見圖5-10）。 圖5-10 使用Attractors分析軟件時(shí)二維點(diǎn)圖的前后變化對(duì)比 5.4 流式細(xì)胞儀的其它應(yīng)用以及數(shù)據(jù)分析 這些分析方法通常適用于計(jì)算離散細(xì)胞群的百分含量，對(duì)于分析單克隆細(xì)胞株分子是否呈陽(yáng)性并不適用。因?yàn)閱慰寺〖?xì)胞株是單個(gè)細(xì)胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽(yáng)性，所以我們通過(guò)幾何均值法和中位法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞熒光密度和陽(yáng)性率。如果樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照組，那么我們認(rèn)為其結(jié)果是陽(yáng)性的，兩者間的差異越大，說(shuō)明細(xì)胞的表達(dá)越高，陽(yáng)性率越高。 如圖5-11所示，左圖為單細(xì)胞群的散射光信號(hào)，右圖為陰性對(duì)照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個(gè)峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。圖5-11 單細(xì)胞株分析圖 除檢測(cè)陽(yáng)性率，幾何均值法和中位法還用于分子（接合子）定量分析。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。如圖5-12所示，Y軸上的圓圈代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取的信息，用于計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的接合點(diǎn)位數(shù)。 圖5-12 使用QuantiCALC軟件計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 我們使用ModFit LTTM軟件進(jìn)行DNA定量分析。因?yàn)镈NA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是離散的，所以我們對(duì)曲線以下的面積進(jìn)行積分，以得到每個(gè)細(xì)胞亞群的百分含量結(jié)果。 圖5-13 細(xì)胞周期的DNA直方圖 習(xí)題：數(shù)據(jù)分析 1二維點(diǎn)圖和一維直方圖的作用分別是什么？ 2 見圖5-4和圖5-5，CD3陰性和陽(yáng)性的百分含量分別是多少。 3 LL象限代表雙陽(yáng)性細(xì)胞亞群。（對(duì) 錯(cuò)） 4 見圖5-6和圖5-7，淋巴細(xì)胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。 5 只能使用矩形設(shè)定細(xì)胞區(qū)域范圍。（對(duì) 錯(cuò)） 6 使用區(qū)域設(shè)定法分析樣本有哪些不足。 7 避免細(xì)胞亞群移動(dòng)的分析方法是什么。 8 在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測(cè)陽(yáng)性率。5.5 CellQuest和CellQuest Pro軟件使用 CellQuest和CellQuest Pro軟件是目前運(yùn)用最為廣泛的流式細(xì)胞儀采集及分析軟件。它運(yùn)行于蘋果電腦上，優(yōu)質(zhì)的矢量圖顯示使得操作界面特別優(yōu)美?，F(xiàn)最新的微軟公司的Vista軟件也是仿蘋果操作系統(tǒng)界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro時(shí)的強(qiáng)大功能及視覺質(zhì)感。CellQuest和CellQuest Pro軟件主安裝在BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀上。1軟件數(shù)據(jù)流程 在CellQuest和CellQuest Pro軟件的數(shù)據(jù)流分為二個(gè)部分：方案和數(shù)據(jù)包。方案是指用戶可以建立采集或分析所需的直方圖或散點(diǎn)圖、設(shè)門并定義門與門、門與圖之間的邏輯關(guān)系?？梢允褂梅桨高M(jìn)行數(shù)據(jù)采集或分析以往已有的數(shù)據(jù)。每個(gè)采集方案分析樣本后會(huì)生成數(shù)據(jù)包，該數(shù)據(jù)包中包括了樣本中每個(gè)顆粒在各個(gè)檢測(cè)參數(shù)上的數(shù)值，格式為FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuest Pro方案文件的圖標(biāo)CellQuest和CellQuest Pro數(shù)據(jù)文件的圖標(biāo)CellQuest和CellQuest Pro軟件中還會(huì)有關(guān)于儀器設(shè)置的文件，保存所有的實(shí)驗(yàn)條件。它只能由CellQuest和CellQuest Pro軟件打開。數(shù)據(jù)包必須由方案文件打開，無(wú)法單獨(dú)顯示，或者可由第三方軟件進(jìn)行分析，如WinMDI。2.軟件與儀器的連接 流式細(xì)胞儀需要加電開啟后會(huì)向計(jì)算機(jī)發(fā)出信息，所以如要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要先開啟流式細(xì)胞儀，然后再開啟計(jì)算機(jī)。1、 先開儀器后開計(jì)算機(jī)，以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。2、 在蘋果菜單下點(diǎn)擊CellQuest和CellQuest Pro軟件。3、 從Aquire菜單下選擇connet to cytometer。3方案與數(shù)據(jù)之間的關(guān)系CellQuest和CellQuest Pro軟件的方案與數(shù)據(jù)相互獨(dú)立保存，數(shù)據(jù)包可以由任一方案文件進(jìn)行分析，分析后不改變數(shù)據(jù)包中的任何數(shù)據(jù)。CellQuest和CellQuest Pro軟件中方案內(nèi)的直方圖或散點(diǎn)圖有三種狀態(tài)：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。當(dāng)圖的屬性為Acquire時(shí)，此圖只限于采集下用，即只當(dāng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)它才能顯示顆粒；當(dāng)圖的屬性為Analysis時(shí)，此圖只限于分析已保存的數(shù)據(jù)包，它不能用于采集數(shù)據(jù)。當(dāng)圖的屬性為Acquire-Analysis時(shí)，此圖即可用于采集數(shù)據(jù)也可用于分析已有數(shù)據(jù)。所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點(diǎn)圖全部設(shè)為Acquire-Analysis屬性。CellQuest Pro CellQuest4方案的建立A選擇實(shí)驗(yàn)參數(shù)默認(rèn)情況下，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀開機(jī)后只打開一根激光器，及五個(gè)參數(shù)供選擇使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。當(dāng)我們要使用第二根激光器及FL4通道時(shí)需要勾選FL4的選項(xiàng)，儀器自動(dòng)打開633nm激光器。選擇Four Color后，儀器自動(dòng)打開第二根激光器，且此時(shí)FL4可用。B,建立散點(diǎn)圖或直方圖，命名坐標(biāo)CellQuest Pro軟件主要工作界面，軟件類似于Office word的工作面，可在A4大小的頁(yè)面上進(jìn)行編輯建立各種直方圖或散點(diǎn)圖。使用工具條可以建立散點(diǎn)圖、直方圖并在圖上設(shè)立各種門。在CellQuest Pro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點(diǎn)圖就會(huì)出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。 在CellQuest軟件下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來(lái)打開圖的屬性對(duì)話框，其中包括了關(guān)于該圖所有選項(xiàng)。建立好直方圖或散點(diǎn)圖后，我們需要對(duì)所選的參數(shù)進(jìn)行命名，如不修改軟件自動(dòng)命名為FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜單上選擇Acquire欄目，選擇Parameter Description，可出現(xiàn)關(guān)于文件存儲(chǔ)和參數(shù)命名的對(duì)話框。在這個(gè)對(duì)話框中用P字母來(lái)代表每個(gè)參數(shù)，并在此對(duì)每個(gè)采集參數(shù)進(jìn)行命名，F(xiàn)L1為CD3FITC，F(xiàn)L2為CD4PE。C,設(shè)門并建立門與圖之間的關(guān)系在工具欄上有左側(cè)幾個(gè)按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動(dòng)門。本處重點(diǎn)介紹Snap-To門，它可根據(jù)細(xì)胞群體的分布自動(dòng)調(diào)整門的形狀適應(yīng)細(xì)胞群體。R與G的關(guān)系R是Region的首個(gè)字母，Region一般是指一個(gè)閉合形的區(qū)域，如矩形區(qū)、自由區(qū)和圓形區(qū)。區(qū)域與區(qū)域之間可以進(jìn)行邏輯運(yùn)算，如AND、OR、NOT等關(guān)系。當(dāng)區(qū)域進(jìn)行運(yùn)算時(shí)軟件引進(jìn)了算術(shù)公式的管理概念：Gate實(shí)際了個(gè)代數(shù)式，簡(jiǎn)稱G，其運(yùn)算式默認(rèn)如下：G1 = R1，或G2=R2當(dāng)我們要進(jìn)行邏輯運(yùn)算時(shí)，可變更為G1=R1 AND R2。此時(shí)G1就成了一個(gè)算術(shù)結(jié)果了。G1=R1 AND R2G2=R1 NOT R2G3=R1 OR R2Region List管理門，可以重命名或刪除門。Gate List是對(duì)門進(jìn)行邏輯運(yùn)算和標(biāo)識(shí)顏色的工具。建立門與圖之間的關(guān)系打開要編輯的直方圖或散點(diǎn)圖的屬性對(duì)話框，選擇Gate選項(xiàng)，選擇門即可。D，顯示統(tǒng)計(jì)參數(shù)如何編輯這些統(tǒng)計(jì)參數(shù)選擇統(tǒng)計(jì)參數(shù)框，在Stats菜單下的Edit Statistic會(huì)變得可用，點(diǎn)出后出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)參數(shù)編輯對(duì)話框。選擇任意直方圖或散點(diǎn)圖，在Stats下拉菜單下會(huì)有更種統(tǒng)計(jì)參數(shù)選項(xiàng)。對(duì)應(yīng)于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。5儀器的操作當(dāng)計(jì)算機(jī)與流式細(xì)胞儀聯(lián)機(jī)后便會(huì)出現(xiàn)以下采集控制框：在有關(guān)儀器操作所有控制選項(xiàng)框都在Cytometer下拉菜單下，同時(shí)按住“蘋果”鍵及1、2、3、4便可調(diào)取所有控制框： 6文件的保存及調(diào)用實(shí)驗(yàn)或分