免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展ppt課件

免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 1 免疫比濁分析技術(shù)原理與進展 桂林英美特生物技術(shù)研究所 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 2 一 免疫學(xué)基本原理二 免疫沉淀三 免疫比濁技術(shù)原理 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 3 一 免疫學(xué)基本原理 1 抗原與抗體2 抗原抗體的結(jié)合 免疫學(xué)反應(yīng)3 免疫學(xué)反應(yīng)的檢測技術(shù) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 4 1 抗原與抗體 抗原 Antigen Ag 是刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì) 應(yīng) 是指抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答產(chǎn)物 抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞 答 是指相應(yīng)抗原與免疫應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合并將其排除體外 抗原的免疫原性和免疫反應(yīng)性完全抗原與半抗原抗原表位與抗原結(jié)合價位 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 5 1 抗原與抗體 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 6 1 抗原與抗體 免疫原性免疫原性 immunogenecity 是指抗原分子能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答 產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞 的性質(zhì) Ag 抗體 免疫原性示意圖 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 7 1 抗原與抗體 免疫反應(yīng)性 是指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物 抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞 發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì) 抗原性 免疫反應(yīng)性 示意圖 抗體 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 8 1 抗原與抗體 完全抗原 completeantigen 具有免疫原性和抗原性的物質(zhì) 半抗原 hapten 又稱不完全抗原incompleteantigen 無免疫原性 只有抗原性的物質(zhì) 載體 carrier 賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì) 半抗原 蛋白質(zhì) 載體 完全抗原 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 9 半抗原 載體 抗體 完全抗原 半抗原 載體效應(yīng)示意圖半抗原 蛋白質(zhì) 載體 完全抗原 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 10 1 抗原與抗體 抗原決定簇 抗原分子存在的能TCR BCR或抗體Fab片段特異性結(jié)合的特殊化學(xué)基團 是免疫應(yīng)答特異性的物質(zhì)基礎(chǔ) 構(gòu)象決定簇 構(gòu)象決定簇 conformationaldeterminant 由空間構(gòu)象形成的決定簇 序列上不連續(xù) 順序決定簇 順序決定簇 sequencedeterminant 又稱線性決定簇 lineardeterminant 序列相連續(xù)的氨基酸肽片段構(gòu)成的決定簇 抗原結(jié)合價 抗原結(jié)合價 antigenicvalence 是指能夠與抗體分子結(jié)合的決定簇數(shù)目 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 11 1 抗原與抗體 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 12 1 抗原與抗體 抗原表位的性質(zhì) 數(shù)目 位置 空間排列和立體構(gòu)象決定著抗原 抗體反應(yīng)的高度特異性 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 13 1 抗原與抗體 共同表位 commonepitope 指不同抗原之間含有的相同或相似的抗原表位 交叉反應(yīng) cross reaction 指抗體或致敏淋巴細(xì)胞對具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反應(yīng) 交叉結(jié)合 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 14 1 抗原與抗體 抗體 antibody Ab 功能性概念是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的 具有免疫功能的球蛋白 抗體主要存在血清中 也存在于如呼吸道粘膜液 小腸粘膜液 唾液以及乳汁等其它體液中 免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 結(jié)構(gòu)性概念具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白 抗體一定是球蛋白 球蛋白未必是抗體 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 15 1 抗原與抗體 抗體的分子結(jié)構(gòu) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 16 1 抗原與抗體 Y 型 四肽鏈重鏈 5種 輕鏈 2種 可變區(qū) V區(qū) 超變區(qū) 又稱CDR互補決定區(qū) 骨架區(qū) FR恒定區(qū) C區(qū) 鉸鏈區(qū) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 17 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 18 1 抗原與抗體 根據(jù)重鏈抗原性的不同 免疫球蛋白可以分為5類 IgG gamma IgA alpha IgM mu IgD delta IgE epsilon 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 19 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 20 1 抗原與抗體 根據(jù)輕鏈C區(qū)抗原性不同 免疫球蛋白可分為2型 kappa 型 lambda 型輕鏈存在于各類免疫球蛋白中同一個免疫球蛋白分子中的輕鏈同型 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 21 1 抗原與抗體 抗體的生物學(xué)功能 特異性結(jié)合抗原超變區(qū) 表位靜電力 氫鍵 范德華力可逆影響因素 PH 溫度 電解質(zhì) 結(jié)合基礎(chǔ) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 22 2 抗原抗體的結(jié)合 免疫學(xué)反應(yīng) 抗原抗體反應(yīng)的原理抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié)構(gòu)互補性與親和性 這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級結(jié)構(gòu)決定的 抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段 第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段 此階段反應(yīng)快 僅需幾秒至幾分鐘 但不出現(xiàn)可見反應(yīng) 第二為可見反應(yīng)階段 抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素 如電解質(zhì) pH 溫度 補體 的影響下 進一步交聯(lián)和聚集 表現(xiàn)為凝集 沉淀 溶解 補體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng) 抗原抗體的結(jié)合使電荷減少或消失 蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體 四種分子間引力 電荷引力 范登華引力 氫鍵結(jié)合力和疏水作用 參與并促進抗原抗體間的特異性結(jié)合 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 23 2 抗原抗體的結(jié)合 免疫學(xué)反應(yīng) 典型的抗原抗體結(jié)合反應(yīng) 特異性識別 形成抗原抗體復(fù)合物 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 24 2 抗原抗體的結(jié)合 免疫學(xué)反應(yīng) 抗原抗體反應(yīng)的特點 特異性按比例可逆性 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 25 2 抗原抗體的結(jié)合 免疫學(xué)反應(yīng) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 26 2 抗原抗體的結(jié)合 免疫學(xué)反應(yīng) 影響抗原抗體反應(yīng)的因素電解質(zhì) 離子強度 抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合后 雖由親水膠體變?yōu)槭杷z體 若溶液中無電解質(zhì)參加 仍不出現(xiàn)可見反應(yīng) 為了促使沉淀物或凝集物的形成 常用0 85 氯化鈉或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液 由于氯化鈉在水溶液中解離成Na 和C1 可分別中和膠體粒子上的電荷 使膠體粒子的電勢下降 當(dāng)電勢降至臨界電勢 12 15mV 以下時 則能促使抗原抗體復(fù)合物從溶液中析出 形成可見的沉淀物或凝集物 酸堿度 pH 抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進行 蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì) 因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點 抗原抗體反應(yīng)一般在pH為6 8進行 PH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì) 例如pH達(dá)到或接近抗原的等電點時 即使無相應(yīng)抗體存在 也會引起顆粒性抗原非特異性的凝集 造成假陽性反應(yīng) 溫度 在一定范圍內(nèi) 溫度升高可加速分子運動 抗原與抗體碰撞機會增多 使反應(yīng)加速 但若溫度高于56 時 可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離 甚至變性或破壞 在40 時 結(jié)合速度慢 但結(jié)合牢固 更易于觀察 常用的抗原抗體反應(yīng)溫度為37 每種試驗都有其獨特的最適反應(yīng)溫度 例如冷凝集素在4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好 20 以上反而解離 其它 適當(dāng)振蕩也可促進抗原抗體分子的接觸 加速反應(yīng) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 27 3 免疫學(xué)檢測技術(shù) 凝集與沉淀比濁電位 微天平 放射性核素標(biāo)記酶標(biāo)記 熒光標(biāo)記和膠體金標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記或偶聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 非標(biāo)記免疫檢測技術(shù) 標(biāo)記免疫檢測技術(shù) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 28 二 免疫沉淀 凝集 細(xì)菌 螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒抗原 在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集 稱為凝集反應(yīng) agglutination 是最經(jīng)典的免疫學(xué)檢測技術(shù) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 29 二 免疫沉淀 免疫沉淀反應(yīng) precipitation 可溶性抗原與相應(yīng)抗體 在適宜條件下發(fā)生結(jié)合 出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象 免疫沉淀 液體內(nèi)沉淀反應(yīng) 凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng) 免疫電泳技術(shù) 免疫濁度技術(shù) 絮狀沉淀試驗 環(huán)狀沉淀試驗 單向擴散試驗 雙向擴散試驗 試管法平板法 免疫電泳對流免疫電泳火箭免疫電泳免疫固定電泳 透射免疫比濁t(yī)urbidimetermeasure散射免疫比濁nephelomitermeasure 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 30 1 2 1 4 1 8 1 16 1 32 1 64 1 128 各管抗原倍比稀釋 加入抗血清 各管抗體量不變 振搖混勻 37 孵育 沉淀量不同 試管內(nèi)絮狀沉淀試驗 輕搖 絮 狀 沉 示 意 圖 淀 Ag AbAg 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 31 Ab Ag 凝膠內(nèi)沉淀 試管法 單向瓊脂擴散試驗 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 32 凝膠內(nèi)沉淀試驗 平板法 標(biāo)準(zhǔn)品抗原濃度測定 不同病人抗原濃度測定 原理 將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中 使待測抗原在凝膠中自由擴散 與相應(yīng)抗體結(jié)合形成沉淀環(huán) 沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關(guān) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 33 凝膠內(nèi)沉淀 雙向瓊脂擴散原理示意圖 Ab Ag 模擬圖 染色瓊脂圖 1 抗原抗體雙向自由擴散2 24小時出結(jié)果3 呈現(xiàn)沉淀線或弧 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 34 三 免疫比濁技術(shù)原理 當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合 二者比例合適時 在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物 使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度 利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器對濁度進行測定從而檢測抗原含量 檢測器 光源透鏡濾光片 平光線 散 射 透射光 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 35 光波 比濁測定法原理示意圖 d 當(dāng)復(fù)合物大于入射光波的1 20時 形成不對稱前向散射 在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果 散射光的量代表復(fù)合物的量 當(dāng)復(fù)合物小于入射波長時呈全透射 透射與散射相當(dāng) 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 36 三 免疫比濁技術(shù)原理 免疫比濁技術(shù)分類 按光路 透射免疫比濁散射免疫比濁 按測定時間 終點比濁速率比濁 按增敏劑 無增敏PEG增敏膠乳增敏 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 37 透射比濁法和散射比濁法光路 檢測器A 檢測器B IC I0 I I 透射比濁法 散射比濁法 透射免疫比濁法是在180 角 即在直射角度上測定光透射強度 散射比濁法在光路的5 96 角的方向上測量散射光強度 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 38 單色器 透射比濁計 散射比濁計 散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖 透射光散射光 散射光 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 39 透射免疫比濁法 transmissionturbidimetry 原理 抗原與抗體在一定緩沖液中形成IC 當(dāng)光線透過反應(yīng)溶液時 由于溶液內(nèi)IC粒子對光線的反射和吸收 引起透射光減少 IC越多透射光越少 可用吸光度表示 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 40 透射免疫比濁法 溶液中形成的復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 35 100nm 溶液中形成的復(fù)合物分子要足夠多控制抗原抗體反應(yīng)的溫度和時間加增敏劑 提高復(fù)合物形成速度 縮短檢測時間應(yīng)選擇親和力好 效價高的抗體 保證抗體過量將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至少5個濃度測定 以吸光度值 A 為縱坐標(biāo) 濃度為橫坐標(biāo) 在半對數(shù)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線 反應(yīng)要求 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 41 透射免疫比濁法 靈敏度較低 要求抗原 抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 足夠多 分子太小則入射光直接通過 加增敏劑 直線光路 靈敏度有先天缺陷 設(shè)計散射比濁 透射比濁是依據(jù)透射光減弱的原理來定量的 因此只能測定抗原 抗體反應(yīng)的第二階段 檢測仍需抗原 抗體溫育反應(yīng)時間 檢測時間較長 缺陷 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 42 散射免疫比濁法 抗原抗體復(fù)合物對一定波長的光產(chǎn)生折射 偏轉(zhuǎn) 偏轉(zhuǎn)角度及散射光強度與復(fù)合物粒子的大小和量有關(guān) 原理 單色器 散射比濁計 散射光 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 43 散射免疫比濁法 定時散射比濁分析 基本原理 免疫沉淀反應(yīng)和散射比濁分析結(jié)合之技術(shù) 反應(yīng)分兩個階段 預(yù)反應(yīng)階段和反應(yīng)階段 保證抗原不過量的方法 確保反應(yīng)體系抗體過量對抗原過量進行閾值限定 時間檢測分兩個 在預(yù)反應(yīng)時段 加小量樣本與抗原 抗體反應(yīng) 測定第一次散射光信號值 加全量樣本 約反應(yīng)2分鐘后 第二次測定散射光信號 信號峰值計算機處理轉(zhuǎn)換為樣品濃度 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 44 預(yù)反應(yīng)階段5ul樣本 抗原過剩區(qū) 閾值 信號 反應(yīng)階段45ul樣本 7 5秒 2分鐘 定時散射比濁反應(yīng)曲線圖 抗原不過量抗原過量 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 45 散射免疫比濁法 速率散射比濁分析 基本原理 抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動態(tài)測定法 適時檢測抗原抗體復(fù)合物形成的散射光信號 是測定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動態(tài)過程 所謂速率 是在單位時間內(nèi)抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速度 將各單位時間內(nèi)形成復(fù)合物的速率及測定的散射信號連接在一起 即是動態(tài)的速率比濁分析 當(dāng)儀器測定到某一時間內(nèi)形成速率下降時 即出現(xiàn)速率峰 該峰值的高低 即代表所測抗原的量 速率峰值一般在25秒時出現(xiàn) 在反應(yīng)介質(zhì)中加入一定量的促凝劑 可加速抗原抗體復(fù)合物的形成 以減少反應(yīng)時間 速率法的優(yōu)點 是快速 不需要減去樣本和試劑本底讀數(shù) 校正結(jié)果也較穩(wěn)定 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 46 抗原濃度遞增 散射光峰值 峰值信號與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖 A B C D F G H I 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 47 反應(yīng)時間 秒 0 60 85 散射率 抗體過量 抗原過量 第二峰值信號 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 48 粒子增強免疫比濁分析技術(shù) 基本原理選擇一種大小適中 均勻一致的膠乳顆粒吸附或交聯(lián)抗體后 當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時 則發(fā)生聚集 單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi) 光線可透過 當(dāng)兩個膠乳顆粒凝聚時 則使透射光減少 這種減少的程度與膠乳凝集成正比 當(dāng)然也與抗原量成正比 特點 變非均相反應(yīng)為均相反應(yīng) 靈敏度提高 0 1ng mL 聚乙烯 聚苯乙烯等高分子膠乳顆粒 直徑100 200nM 以物理吸附 多抗 或化學(xué)交聯(lián) 單抗 方式與抗體連接 基于單抗膠乳免疫散射速率比濁技術(shù)的定量分析是發(fā)展方向 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 49 光波 d d 2d 當(dāng)粒子直徑小于入射波長時呈全透射 透射與散射相當(dāng) 當(dāng)粒子直徑大于入射光波的1 20時 形成不對稱前向散射 在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果 散射光的量代表復(fù)合物的量 免疫比濁檢驗技術(shù)原理與進展 50 特定蛋白分析儀簡介 以免疫比濁法原理設(shè)計的特定蛋白分析儀有1970年ImmunoPreciptin 1977年BEHRING公司開發(fā)的BL BehringLaserNephelometer 而后該公司又先后于1985年研制出BN BehringNephelometerAnalysers 1987年研制出TTS TurbiTimeSystem 和1988年開發(fā)出BN 100 BehringNephelometer100 美國BECKMAN公司也在80年代推出ARRAY360和ARRAY360E兩種型號的特定蛋白分析儀