β-酪啡肽-7功效學(xué)研究進(jìn)展

酪啡肽 7功效學(xué)研究進(jìn)展 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生M150879 目錄 一 酪啡肽的簡(jiǎn)介 1 酪啡肽的定義 2 酪啡肽的發(fā)現(xiàn) 3 酪啡肽的結(jié)構(gòu)特征二 酪啡肽 7的制備 分離 純化 鑒定 三 酪啡肽 7的主要生理功能及研究進(jìn)展四 展望 酪啡肽的定義 酪啡肽又稱酪蛋白嗎啡 酪蛋白阿片肽 外啡肽 是酪蛋白在消化酶作用下釋放的 能被機(jī)體直接吸收 具有多種生物學(xué)功能的乳源生物活性肽之一 是重要的乳源阿片肽 它具有行為調(diào)節(jié)及免疫調(diào)節(jié)作用 能抑制腸道運(yùn)動(dòng) 促進(jìn)胰島素分泌 對(duì)產(chǎn)乳及內(nèi)源性器官發(fā)育生長(zhǎng)因子有協(xié)同作用 酪蛋白是乳中最重要的成分 乳源生物活性肽是酪蛋白在消化酶作用下釋放的 能被機(jī)體直接吸收 具有多種生物學(xué)功能 其中酪啡肽是最重要的乳源生物活性肽之一 酪啡肽 7 beta asomor phin 7p 是從牛乳 酪蛋白的酶解產(chǎn)物中分離出來的具有阿片活性的七肽物質(zhì) 為 酪蛋白第60 66氨基酸殘基片段 酪啡肽的發(fā)現(xiàn) 1979年 Brantl等在豚鼠回腸縱肌腸肌中分離到一個(gè)牛乳酪蛋白的酶解產(chǎn)物 其是一個(gè)含有7個(gè)氨基酸殘基的寡肽 命名為 酪啡肽 7 序列為Tyr Pro Phe Pro Gly Pro lle 為牛 酪蛋白第60 66位氨基酸殘基片段 它具有很高的阿片活性 能夠與u型阿片受體結(jié)合 后來人們又發(fā)現(xiàn)了 酪啡肽 4 酪啡肽 5 酪啡肽 6 酪啡肽 8 酪啡肽 11 酪啡肽的發(fā)現(xiàn) 酪啡肽的結(jié)構(gòu)特征 牛 酪啡肽是由牛 酪蛋白分解產(chǎn)生的含有3 11個(gè)氨基酸的多肽 都是以牛 酪蛋白的第60位的酪氨酸作為起始氨基酸 人的 酪啡肽的結(jié)構(gòu)和牛的非常相似 在N端都具有Tyr Pro Phe 酪氨 脯 苯丙 的序列 目前科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了多種長(zhǎng)度的 酪啡肽 其主要包括 CM 4 CM 5 CM 6 CM 7 CM 8和 CM 11 研究表明 對(duì)于所有含有不同數(shù)量氨基酸殘基的 酪啡肽 在N 末端含有相同的氨基酸序列Tyr Pro Phe 這對(duì)于保持 一酪啡肽的生物活性是非常重要的 在酶促降解方面 一酪啡肽是非常穩(wěn)定的 其能夠抵抗多種蛋白酶 如胃蛋白酶和胰蛋白酶 的降解 這種特性與其肽鏈中富含脯氨酸有關(guān) 酪啡肽 7的制備 人和動(dòng)物乳被認(rèn)為是最接近完美的食品 酪蛋白是乳中最主要的蛋白 占乳蛋白的80 左右 這些生物活性肽本身以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)氨基酸序列之中 當(dāng)在一定條件受蛋白酶作用下 可形成有活性的生物活性肽 一酪啡肽 7是從牛乳 酪蛋白的酶解物中分離出來的具有阿片活性的一個(gè)七肽物質(zhì) 酪啡肽 7的制備 一 酪蛋白酶解方法 稱取600mg酪蛋白 加雙蒸水溶解 另加少量NaOH助溶 待酪蛋白充分溶解后加少量HC1 定容 稱取胃蛋白酶 使酶與底物濃度之比為1 25 于37 水浴保溫 實(shí)驗(yàn)組保溫時(shí)間分別作用60min 90min 120min 150min 酶解結(jié)束后加入15 三氯乙酸終止反應(yīng) 取上清 用NaOH調(diào)整pH至7 1 二 反相高效液相色譜 RP HPLC 鑒定酪蛋白酶解產(chǎn)物中的 CM 7方法 1 待測(cè)液的預(yù)處理 取各時(shí)間點(diǎn)酪蛋白酶解液的上清液2m1 經(jīng)0 22um微孔濾膜過濾 用于RP HPLC分析 2 用緩沖液平衡層析柱 待運(yùn)行結(jié)果顯示穩(wěn)定的基線時(shí) 分別取各時(shí)間點(diǎn)的20ul酪蛋白酶解上清液手工進(jìn)樣 3 檢測(cè)波長(zhǎng)215nm 流速0 75 線性洗脫運(yùn)行30min 4 將加樣酪蛋白酶解上清液換成 CM 7標(biāo)準(zhǔn)品 制定標(biāo)準(zhǔn)峰 5 內(nèi)標(biāo)法檢測(cè) 在待測(cè)樣品中加入標(biāo)準(zhǔn) CM 7溶液 用以增強(qiáng)待測(cè)樣品的分析結(jié)果 三 葡聚糖凝膠 Sephadex G 15凝膠層析分離純化酪蛋白酶解上清液結(jié)果 120min酪蛋白酶解上清液 經(jīng)葡聚糖凝膠G 15層析結(jié)果圖 在215nm消光讀數(shù) 繪制的洗脫曲線 收集不同組分洗脫液 按管號(hào)為6 19 20 35 36 50 51 73 74 89 90 120加以合并 得到6個(gè)組分 其中第六組分 箭頭所指 中最有可能含有 CM 7等小分子物質(zhì) 三 酪啡肽 7的主要生理功能及研究進(jìn)展 酪啡肽的主要生理功能 1 對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)的影響 降低收縮力 抑制葡萄糖吸收等 2 對(duì)免疫功能的影響 促進(jìn)免疫器官發(fā)育等 3 對(duì)生殖內(nèi)分泌的影響 影響動(dòng)物發(fā)情 排卵 性成熟等 4 對(duì)采食的影響 增加高脂飼料采食等 5 鎮(zhèn)痛 鎮(zhèn)靜作用 作用同嗎啡 鎮(zhèn)靜止痛 誘導(dǎo)睡眠 6 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用 促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng) 7 其它作用 導(dǎo)致健忘癥 抗焦慮 研究進(jìn)展 1 Brantl等發(fā)現(xiàn) 酪啡肽 7能夠顯著降低豚鼠回腸收縮力 2 談寅飛等體外研究發(fā)現(xiàn) 酪啡肽 7可促進(jìn)仔豬胃竇分泌胃泌素 3 宗亞峰的研究發(fā)現(xiàn) 酪啡肽 7能夠抑制小腸對(duì)葡萄糖的吸收 4 凌明亮等還發(fā)現(xiàn) 酪啡肽 7能夠增加小腸對(duì)D一木糖的吸收能力 5 顧芳等人研究發(fā)現(xiàn) 酪啡肽 7能夠防止酒精性脂肪肝 6 潘翠玲發(fā)現(xiàn)飼喂 酪啡肽 7能夠促進(jìn)仔豬免疫器官和組織的發(fā)育 7 皮下注射 酪啡肽 7能夠引起類似組胺引起的丘疹和炎癥反應(yīng) 8 研究發(fā)現(xiàn)外周注射 酪啡肽 7能夠刺激大鼠增加高脂飼料的采食 9 印虹等人研究發(fā)現(xiàn)乳源 酪啡肽 7具有降血糖作用 10 腹腔注射 酪啡肽 7能夠顯著降低大鼠尾夾疼痛反應(yīng) 11 酪啡肽 7及其衍生物也能夠增加?jì)雰核?12 Han等研究發(fā)現(xiàn) 酪啡肽 7能夠減輕糖尿病大鼠心臟的損傷 13 實(shí)驗(yàn)證明給白化的大鼠飼喂 酪啡肽 7能夠產(chǎn)生抗焦慮的作用 6 潘翠玲發(fā)現(xiàn)飼喂 酪啡肽 7能夠促進(jìn)仔豬免疫器官和組織的發(fā)育 一 材料與方法1 飼養(yǎng)動(dòng)物將來源于日齡 體質(zhì)量相近的12頭三元雜交仔公豬隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組 每天喂料4次 自由飲水 以紅外燈保溫 室內(nèi)溫度25 2 濕度81 85 試驗(yàn)前及試驗(yàn)過程中疫病防治均按該場(chǎng)的常規(guī)方案進(jìn)行試驗(yàn)組的仔豬于21日齡斷乳 與母豬隔離 飼養(yǎng)在保育室 在飼喂早期斷乳仔豬料的基礎(chǔ)上 每頭每天添喂10umol L 酪啡肽 7的溶液20mL 分2次喂給 連續(xù)添喂10d 對(duì)照組的仔豬隨母豬飼養(yǎng)在產(chǎn)仔室繼續(xù)吃母乳到28日齡時(shí)斷乳 移入保育室飼養(yǎng) 飼喂與試驗(yàn)組相同的仔豬料 2組均于32日齡捕殺 2 樣品處理 收集胃和十二指腸內(nèi)容物 按1 1的比例用生理鹽水將內(nèi)容物稀釋 4 3000r min離心15min 取上清液測(cè)相關(guān)酶的活性 取2cmX2cm的胃竇 截取十二指腸的中部 空腸前段 空腸的前1 3 的中部 回腸的中部各2cm 用生理鹽水沖去內(nèi)容物 置于Bouin氏液固定 常規(guī)石蠟切片 厚度為6um HE染色 樹膠封片用Olymps顯微鏡觀察并照相 3 檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)用Image processing plus圖象分析系統(tǒng)測(cè)量腸絨毛長(zhǎng)度 絨毛寬度 腺隱窩深度和腸壁肌層厚度 測(cè)定仔豬胃內(nèi)容物的胃蛋白酶總活性 測(cè)定仔豬十二指腸內(nèi)容物的淀粉酶活性 脂肪酶活性 胰蛋白酶總活性 4 數(shù)據(jù)處理采用Excel分析軟件 平均數(shù)值以X平均 S表示 用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 1 與對(duì)照組相比 試驗(yàn)組的仔豬胃竇粘膜厚度比對(duì)照組增厚61 98 2 與對(duì)照組相比 試驗(yàn)組的仔豬十二指腸絨毛長(zhǎng)度比對(duì)照組增長(zhǎng)34 47 絨毛寬度與對(duì)照組的相近 腸壁肌層的厚度低于對(duì)照組 腸隱窩深度加深 而腸絨毛長(zhǎng) 隱窩深的比值比對(duì)照組的大16 98 3 與對(duì)照組相比 添喂 酪啡肽 7溶液的仔豬 十二指腸內(nèi)容物胰蛋白酶總活性比對(duì)照組的低24 39 P 0 05 而胃蛋白酶總活性 淀粉酶活性 脂肪酶活性均極顯著低于對(duì)照組 所以說 酪啡肽 7確實(shí)有促進(jìn)斷奶仔豬免疫器官發(fā)育的功能 返回 9 印虹等人研究發(fā)現(xiàn)乳源 酪啡肽 7具有降血糖作用 1 動(dòng)物分組與處理健康成年SD大鼠16只 自由采食 飲水 預(yù)飼1周后 隨機(jī)分成對(duì)照組和 CM 7組 分別灌喂生理鹽水 對(duì)照組 7 5X10 6 mol L CM 7組 每天兩次 每次1mL 間隔12h 連續(xù)灌喂30天 期間每隔5天斷尾采血 動(dòng)態(tài)觀察血中葡萄糖濃度的變化 2 樣品采集及處理在試驗(yàn)的第30天 禁食12h 宰殺大鼠 靜脈采血 血液放置1h后 以3000rpm離心15min 分離血清并吸取分裝 20 保存?zhèn)溆?取肝臟 右側(cè)腿肌 放入自封袋 20 保存 取出小腸 用冰冷生理鹽水沖洗 翻轉(zhuǎn)小腸后再漂洗 將洗凈的小腸用吸水紙吸干表面的液體 用載玻片輕刮下小腸豁膜 80 保存?zhèn)溆?3 指標(biāo)測(cè)定 1 血液中葡萄糖濃度測(cè)定按試劑盒說明書氧化酶法測(cè)定血清中葡萄糖濃度 具體取血清10uL 加入1mL葡萄糖測(cè)定液 37 水浴15min后 冷卻 在波長(zhǎng)505nm處測(cè)定其OD值 根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算血糖值 G OD測(cè)定管 OD標(biāo)準(zhǔn)管 5 55mmol L 2 肝糖原 肌糖原含量的測(cè)定按試劑盒說明稱取肝臟 肌肉各80mg左右 按照體積比1 3加堿液后沸水煮20min 流水冷卻 加蒸餾水稀釋成1 肝臟 5 肌肉的糖原檢測(cè)液 取檢測(cè)液100uL 顯色液2mL 置沸水煮5min 冷卻 在波長(zhǎng)620nm處測(cè)OD值 根據(jù)下面計(jì)算肝糖原二測(cè)定管OD值 標(biāo)準(zhǔn)管OD值 標(biāo)準(zhǔn)管含量 樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù) 100 10 1 11肌糖原二測(cè)定管OD值 標(biāo)準(zhǔn)管OD值x標(biāo)準(zhǔn)管含量x樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù) 20 1011 11 3 血清中胰島素 胰高血糖素水平的測(cè)定胰島素測(cè)定 取100uL血清 加入豚抗一Ins 抗體100uL 125I Ins 100uL 混勻放置16 18h 加入Ins 驢抗豚免疫分離劑500uL 充分混勻后 室溫放置15min 3500rpm離心15min 吸棄上清 測(cè)各管沉淀物的放射性計(jì)數(shù) cpm 胰高血糖素檢測(cè) 取200uL血清 加入豚抗一Glu 抗體100uL 混勻室溫放置4h 加入125I Glu 100 L 混勻放置16 18h 加入Glu 驢抗豚免疫分離劑500uL 充分混勻后 室溫放置15min 3500rpm離心15min 吸棄上清 測(cè)各管沉淀物的放射性計(jì)數(shù) cpm 4 參照戴岳方法測(cè)定腸黏膜a 葡萄糖苷酶活性 5 將刮取的腸囊黏膜 按照試劑盒說明檢測(cè)其Na K ATP酶活力 6 小腸上皮黏膜SGLT 1mRNA表達(dá)分析提取樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄 設(shè)計(jì)目的基因引物 序列分析 SGLT 1mRNA的RT PCR分析 重復(fù)兩次 7 數(shù)據(jù)處理采用SPSS13 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因子方差分析 OnewayANOVA LSD 所有數(shù)值以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤 Mean SE 表示 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)論 與對(duì)照組相比 灌喂 CM 7組大鼠血糖水平略低于對(duì)照組 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在25天時(shí)差異顯著 其余差異不顯著 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)論 灌喂 CM 7組大鼠肝糖原含量與對(duì)照組比較差異不顯著 p 0 73 肌糖原含量與對(duì)照組相比 極顯著降低 p 0 001 即 CM 7能夠降低肌糖原的含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)論 灌喂 CM 7組大鼠胰島素 胰高血糖素含量與對(duì)照組相比 差異均不顯著 即 CM 7對(duì)血糖含量的影響不是直接通過糖相關(guān)激素影響的 CM 7對(duì)大鼠小腸站膜SGLT 1mRNA表達(dá)的影響 n 8 A為RT PCR電泳圖 B柱狀圖為SGLT 1與 actinmRNA 信使 的灰度比分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果提示 CM 7可以下調(diào)小腸黏膜SGLT 1mRNA的表達(dá) 總結(jié) 連續(xù)灌喂 CM 7大鼠血糖濃度較灌喂生理鹽水有降低 但二者之間差異不顯著 p 0 35 肝糖原 胰島素 胰高血糖素 a 葡萄糖普酶活力 Na K ATP酶活力二組之間均無明顯差異 試驗(yàn)組肌糖原含量低于對(duì)照組 p 0 001 SGLT1mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組 p 0 02 結(jié)論 CM 7具有輔助降血糖作用 其機(jī)制可能是通過下調(diào)小腸黏膜上皮SGLT 1mRNA的表達(dá) 減少腸道葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn) 并增加肌糖原的消耗 生物