組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室儀器及操作技術(shù)ppt課件

.,植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室及操作技術(shù),第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù)第二節(jié)組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營(yíng)養(yǎng)成分第三節(jié)培養(yǎng)基的配制與滅菌,.,第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù),一、實(shí)驗(yàn)室組成二、基本設(shè)備三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具四、洗滌技術(shù)五、滅菌技術(shù)六、無(wú)菌操作,.,組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察,一、實(shí)驗(yàn)室組成,.,基本實(shí)驗(yàn)室,輔助實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)室組成,準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌操作室培養(yǎng)室,細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫室生化分析實(shí)驗(yàn)室,.,基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖,實(shí)驗(yàn)臺(tái),擱架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,藥品及儀器柜,無(wú)菌臺(tái),無(wú)菌臺(tái),擱架,拉窗,冰箱,擱架,水槽,電爐,門,4.5m,3.0m,3.5m,4.0m,準(zhǔn)備室,緩沖室,無(wú)菌室,培養(yǎng)室,.,組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室,.,緩沖室,.,培養(yǎng)室,.,無(wú)菌室（一）,.,無(wú)菌室（二）,.,二、儀器與設(shè)備,1、基本設(shè)備冰箱、電爐、酸度計(jì)、純水器、天平、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。,.,冰箱,酸度計(jì),電爐,.,天平,純水器,.,培養(yǎng)基分裝器,攪拌器,.,2、滅菌設(shè)備蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過(guò)濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。,.,蒸汽壓力滅菌鍋,.,干熱消毒柜,.,無(wú)菌瓶頂過(guò)濾裝置,噴霧消毒器,（參考圖）,（參考圖）,.,3、無(wú)菌操作設(shè)備,超凈工作臺(tái),.,無(wú)菌接種箱,.,4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備,搖床,.,培養(yǎng)架,.,HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱,150C250D光照培養(yǎng)箱,.,5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備光學(xué)研究顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、倒置顯微鏡,倒置顯微鏡,光學(xué)顯微鏡,.,1、玻璃器皿,三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具,培養(yǎng)皿,三角瓶,培養(yǎng)瓶,.,2、金屬材質(zhì)用具,鑷子,解剖刀,接種針,.,四、洗滌技術(shù),1、玻璃器皿洗滌,新購(gòu)置玻璃器皿,1%稀HCl,浸漬12h,洗衣粉洗滌,清水沖洗,晾干備用,已用過(guò)的玻璃器皿,.,2、塑料用品洗滌,新的塑料器皿打開(kāi)即用,已用過(guò)的塑料器皿,2%NaOH浸泡12h,清水沖洗,2%5%鹽酸浸泡30min,清水沖洗,蒸餾水沖洗,晾干備用,.,3、金屬用品洗滌,熱洗衣粉水洗凈,沖洗,擦干,.,清潔液配方,.,五、滅菌技術(shù),物理方法：物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、物理除菌、過(guò)濾、離心、沉淀等化學(xué)方法：消毒劑、抗菌素滅菌,1、滅菌方法,.,2、滅菌,（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法壓力在9.810410.8104Pa溫度在121滅菌2030min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌干熱消毒滅菌,.,飽和蒸汽壓力與其對(duì)應(yīng)的溫度,.,（3）塑料器皿滅菌：多采用高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用,.,（5）接種室滅菌,空氣消毒滅菌,接種室,超凈工作臺(tái),紫外燈照射,70%75%的酒精擦洗,培養(yǎng)材料的接種,紫外燈照射,.,（6）外植體滅菌,流水沖洗1020min或更長(zhǎng)時(shí)間,70%75%酒精中浸泡30s,0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右,蒸餾水沖洗45次,在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右,備用,.,常用消毒劑消毒滅菌比較表,.,六、無(wú)菌操作,實(shí)驗(yàn)員消毒,實(shí)驗(yàn)室、無(wú)菌臺(tái)滅菌,實(shí)驗(yàn)器材的滅菌,無(wú)菌接種,消毒,實(shí)驗(yàn)臺(tái)衛(wèi)生,培養(yǎng)室培養(yǎng),.,1、消毒，更換實(shí)驗(yàn)服、帽子與鞋子，進(jìn)入接種室。2、打開(kāi)超凈工作臺(tái)和無(wú)菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關(guān)閉。3、開(kāi)啟過(guò)濾室風(fēng)機(jī)，使無(wú)菌風(fēng)吹拂工作臺(tái)面和四周的臺(tái)壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作臺(tái)和雙手。,.,5、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進(jìn)工作臺(tái)。6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精燈火焰附近切割備用的接種材料。8、打開(kāi)瓶口，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口使瓶口各部分都燒到。,.,9、取下接種器械，在火焰上消毒。10、把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。11、接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺(tái)。,注意：操作期間應(yīng)經(jīng)常用70%75%的酒精擦拭工作臺(tái)和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。,.,第二節(jié)植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營(yíng)養(yǎng)成分,一、所需環(huán)境條件,與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的材料的生長(zhǎng)要受到溫度、光照、濕度等各種物理?xiàng)l件，不同氣體、培養(yǎng)基的組成、pH值和滲透壓等各種化學(xué)條件，以及外植體部位、大小、細(xì)胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來(lái)控制培養(yǎng)條件是組織培養(yǎng)中的一個(gè)重要問(wèn)題。,.,溫度光照濕度氣體培養(yǎng)基的滲透壓pH值,植物材料一般最適溫度在252之間,環(huán)境條件,最常用的光周期是光照16h，黑暗8h,一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對(duì)濕度應(yīng)達(dá)100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對(duì)濕度在70%80%,氧氣是愈傷組織生長(zhǎng)所必需的,調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手,植物組織培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基的pH值大多在5.06.5,.,二、營(yíng)養(yǎng)成分,植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等點(diǎn)化學(xué)方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。,.,Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營(yíng)養(yǎng)元素的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn),A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補(bǔ)充改元素來(lái)預(yù)防和恢復(fù)C、改元素在植物營(yíng)養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而產(chǎn)生的間接效果。,.,國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素有16（17）種：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。,.,根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為大量營(yíng)養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種微量營(yíng)養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種,按照國(guó)際植物生理協(xié)會(huì)的建議：所需濃度0.5mmol/L的元素為大量元素所需濃度0.5mmol/L的元素為微量元素,.,1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動(dòng)中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4NaH2PO4等。K對(duì)碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。,.,Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對(duì)細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。,.,2、微量元素在微量元素中，鐵的使用最大：一些氧化酶的組成成分葉綠素形成的必要條件使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀,.,硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運(yùn)輸有著密切的關(guān)系銅是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生長(zhǎng)錳參與植物的光合、呼吸代謝鉬參與氮素的代謝氯是光合作用水光解的活化劑微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。,.,缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢(shì)發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨~緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。,桃樹(shù),.,缺銅癥狀：新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)大變成深褐色，引起落葉。枝頂端生長(zhǎng)不良，其下部的芽開(kāi)始生長(zhǎng)，形成叢生的細(xì)枝。,菊花,.,缺錳典型癥狀：葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開(kāi)始。,菜豆,.,缺鉬典型癥狀：葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點(diǎn)，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時(shí)葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。,白菜,.,缺硼典型癥狀：受精不良,籽粒減少，“花而不實(shí)”，“蕾而不花”；根尖、莖尖的生長(zhǎng)點(diǎn)停止生長(zhǎng)，而形成簇生狀；常引起各種腐爛病。,馬鈴薯,.,3、碳源碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類物質(zhì)最重要。糖類物質(zhì)特點(diǎn)：具有熱易變的性質(zhì)利于吸收和利用使用濃度一般在2%5%提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓,.,4、維生素類以各種輔酶的形式存在參與多種代謝活動(dòng)對(duì)生長(zhǎng)，分化等有很好的促進(jìn)作用主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素常用維生素有VB1和VB6,.,5、肌醇環(huán)己六醇細(xì)胞壁的構(gòu)建材料參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動(dòng)促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用,.,6、氨基酸蛋白質(zhì)的組成成分有機(jī)氮源可直接被細(xì)胞吸收利用培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸7、天然復(fù)合物促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長(zhǎng)化學(xué)成分不明、復(fù)雜天然營(yíng)養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物,.,8、瓊脂是使用最普遍的凝固劑用量一般在610g/L之間顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。,.,9、活性炭吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)抑制外植體褐變防止玻璃苗的產(chǎn)生促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)和分化促進(jìn)生根缺點(diǎn)：沒(méi)有選擇性10、抗生素防止外植體內(nèi)生菌造成的污染,活性炭,.,11、生長(zhǎng)素類促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂促進(jìn)生根、抑制器官脫落、性別控制、延長(zhǎng)休眠、頂端優(yōu)勢(shì)、單性結(jié)實(shí)誘導(dǎo)愈傷組織形成溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好常用的生長(zhǎng)素：IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸),.,12、細(xì)胞分裂素類促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成延緩組織的衰老并增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成用于離體成花的調(diào)控溶于0.51.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中常用的細(xì)胞分裂素：KT(激動(dòng)素)BA(6-卞基腺嘌呤)2-ip(異戊烯氨基嘌呤)玉米素,.,13、赤霉素類和脫落酸A、赤霉素類組織培養(yǎng)中不常使用加速細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)胞的分裂主要是GA3B、脫落酸抑制細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)促進(jìn)脫落和衰老促進(jìn)休眠和提高抗逆能力,.,培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基,一、培養(yǎng)基的種類,第三節(jié)培養(yǎng)基的配制、滅菌與保存,.,1、MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度高高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽含有一定數(shù)量的銨鹽營(yíng)養(yǎng)豐富不需要添加更多的有機(jī)附加物,二、幾種常見(jiàn)培養(yǎng)基的特點(diǎn),.,.,2、White培養(yǎng)基1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)1963年作了改良，提高M(jìn)gSO4的濃度和增加硼元素?zé)o機(jī)鹽濃度較低使用廣泛在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果,附表：White培養(yǎng)基,.,3、B5培養(yǎng)基1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)含有較低的銨鹽較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素,B5培養(yǎng)基的組成和配方,.,4、N6培養(yǎng)基1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)KNO3和（NH4）SO4含量高，不含鉬,N6培養(yǎng)基組成及配方,.,配制培養(yǎng)基應(yīng)做好幾點(diǎn)工作：1、實(shí)驗(yàn)用具的準(zhǔn)備。包括配制過(guò)程中所需電爐、酸度計(jì)、高壓滅菌鍋等設(shè)備及其他玻璃器皿的清洗和準(zhǔn)備2、試劑、藥品的準(zhǔn)備3、根據(jù)培養(yǎng)基的配方、母液擴(kuò)大倍數(shù)及需要配制的培養(yǎng)基體積計(jì)算所需各種母液及其他附加物的量,三、培養(yǎng)基的配制,.,.,具體操作如下：1、取規(guī)定數(shù)量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷鍋內(nèi)，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；2、根據(jù)計(jì)算所需量依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液及其他特殊的附加物，攪拌均勻；3、加水定容至規(guī)定體積，攪拌均勻；4、調(diào)整培養(yǎng)基的pH值；5、分裝；6、封口。,.,組織培養(yǎng)必須在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，因此培養(yǎng)基的滅菌操作非常重要。培養(yǎng)基分裝封口后立刻進(jìn)行滅菌，至少在24h內(nèi)完成滅菌程序。一般采用的是高壓蒸汽滅菌。,四、培養(yǎng)基的滅菌,.,.,滅菌鍋有很多種，實(shí)驗(yàn)室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時(shí)要注意一下幾點(diǎn)：1、鍋中應(yīng)放足量的水，以免造成空燒