第八章 植物基因的克隆原理與技術(shù)

.,第八章植物基因的克隆原理與技術(shù),.,內(nèi)容,一基因克隆所需要的酶和載體二植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建三基因克隆的方法,.,基因克隆所需要的酶和載體,.,一般認(rèn)為基因工程誕生于1973年上世紀(jì)40年代70年代初分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明對于基因工程的誕生起到了決定性的作用。,.,1-DNA是遺傳物質(zhì)被證實(shí),1944年，AveryO.T.肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),.,1953年，JamesWatson和FrancisCrick提出了DNA的雙螺旋模型。,.,以Nireberg等為代表的一批科學(xué)家確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一個(gè)氨基酸，到1966年，全部破譯了64個(gè)密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。,.,Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII，1972年，Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了coRI一類重要的限制性內(nèi)切酶。,WernerArber1968年發(fā)現(xiàn)限制酶,.,1967年，世界上五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年Khorana等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。,.,1970年，Baltimore等和Temin等各自發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，完善了中心法則，使單個(gè)真核基因的制備成為了可能。,.,1972年，美國Stanford大學(xué)的P.Berg等首次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的體外重組。,.,1973年，Stanford大學(xué)的Cohen等成功地利用體外重組實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。這一年被定為基因工程誕生的元年。,.,植物基因工程的基本流程,.,基因克隆所需要的酶類,限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA修飾酶核酸外切酶單鏈DNA內(nèi)切酶,“”,.,1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名和分類3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng),限制性核酸內(nèi)切酶,.,限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)50年代發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌具有對付噬菌體和外來DNA的限制系統(tǒng)；60年代后期證明了細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)；1968年，Meselson和Yuan從大腸桿菌K和B中發(fā)現(xiàn)了I型限制性核酸內(nèi)切酶；1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個(gè)II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。,.,限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。,修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。,.,限制性核酸內(nèi)切酶的概念,限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。已經(jīng)從近300種微生物中分離出了2300種，其中商品化的限制性核酸內(nèi)切酶500余種。,.,限制性核酸內(nèi)切酶的命名,1、寄主菌屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)斜體字母的略語表示酶來源的菌種名稱。如：大腸桿菌Escherichiacoli表示為Eco；,屬名,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示為Hin；,種名,.,2、修飾性酶用M表示，限制性酶用R表示如R.HinM.Eco3、用一個(gè)正體字母表示菌株的類型如EscherichiacoliRY13EcoR4、以羅馬數(shù)字表示分離出來的先后順序如EcoRI、HindIII,.,限制性內(nèi)切核酸酶類型：目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。I型限制性內(nèi)切酶II類限制性內(nèi)切酶III類限制性內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶的分類,.,不同類型核酸內(nèi)切酶主要特性的比較分析,I型,II型,III型,限制-修飾活性,單一多功能的酶,限制酶和修飾酶分開,雙功能酶,內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),3種不同亞基,單一成分,2種不同亞基,活性輔助因子,ATP、Mg2+、SAM,ATP、Mg2+、SAM,Mg2+,甲基化位點(diǎn),寄主特異性的位點(diǎn),特異性切割,否,是,否,基因克隆中的用途,用途有限,十分廣泛,用途有限,.,II型限制性核酸內(nèi)切酶的3大特點(diǎn),識別位點(diǎn)的特異性識別序列的對稱性切割位點(diǎn)的規(guī)范性,.,與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念,粘性末端(cohesiveends)：因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上不同（對稱）酶切后形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個(gè)粘性末端很容易通過互補(bǔ)堿基的配對而重新連接起來。,5端凸出（如EcoRI）,3端凸出（如PstI）,.,平末端(Bluntend)：因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結(jié)構(gòu)，這種末端不易重新連接起來。,.,同裂酶(isoschizomers)：能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同內(nèi)切酶。,完全同裂酶識別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同如Hind和HsuI,不完全同裂酶識別位點(diǎn)相同但切點(diǎn)不同如XmaI和SmaI,XmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5SmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5,.,同尾酶(isocaudamers):識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。注意：由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。,BamHI,GGATCC,CCTAGG,5-,-3,3-,-5,BglII5-AGATCT-33-TCTAGA-5,.,經(jīng)同尾酶消化的DNA末端連接示意圖,5XXXXGGATCCXXXXXX33XXXXCCTAGGXXXXXX5,BamHI,5XXXXGGATCCXXXXXX33XXXXCCTAGGXXXXXX5,5XXXXAGATCTXXXXXX33XXXXTCTAGAXXXXXX5,BglII,5XXXXAGATCTXXXXXX33XXXXTCTAGAXXXXXX5,5XXXXAGATCCXXXXXX33XXXXTCTAGGXXXXXX5,5XXXXAGATCCXXXXXX33XXXXTCTAGGXXXXXX5,BamHI,BglII,.,影響酶活性的因素很多：DNA的濃度和質(zhì)量是影響酶切的最為關(guān)鍵的因素純度的鑒定：紫外吸光值A(chǔ)260/A280濃度低于500ng/L酶切消化的緩沖液Mg2+Tris-HCLBSA（牛血清蛋白）酶切反應(yīng)的溫度（通常為37）影響酶切消化的其他因素時(shí)間體積RNA,限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng),.,酶切反應(yīng)的基本步驟,Buffer(10)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,.,1、DNA連接酶作用的機(jī)理2、DNA連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略,DNA連接酶及其應(yīng)用,.,DNA連接酶的發(fā)現(xiàn),T4DNA連接酶:由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。容易制備，而且可以連接完全配對的平末端DNA分子，所以在基因克隆中應(yīng)用廣泛。,DNA連接酶:由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子。,從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。,.,DNA連接酶作用的特點(diǎn),A.連接的兩條鏈必須分別具有3端自由羥基（-OH）和5端磷酸基團(tuán)（-P），而且只有這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰時(shí)才能進(jìn)行連接反應(yīng)；B.連接反應(yīng)必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，即ATP和NAD+。,.,DNA連接反應(yīng)的條件,CK-,CK+,重組菌,影響連接效率的因素有：溫度（最主要的因素）dNTP的濃度(10M-1M)連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）反應(yīng)時(shí)間（通常連接過夜）插入片段和載體片段的摩爾比,.,平末端DNA片段的末端加尾連接法,.,平末端DNA片段加接頭連接法,銜接物(linker)，也叫接頭，是有人工化學(xué)合成的一段10-12個(gè)核苷酸的DNA雙鏈，其中包含有1個(gè)或幾個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。使用時(shí)只須將銜接物和目的片段的5端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性末端的DNA片段。,CCGAATTCGGGGCTTAAGCC,磷酸化,CCGAATTCGGGGCTTAAGCC,P,OH,OH,P,P,P,OH,OH,T4連接酶,CCGAATTCGGGGCTTAAGCC,P,OH,P,OH,EcoRI,CCGAATTCGGGGCTTAAGCC,AATTCGGGCC,CCGGGCTTAA,.,.,大腸桿菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶Taq聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶及其應(yīng)用,.,常用DNA聚合酶的特性比較,.,逆轉(zhuǎn)錄酶一種可以有效地將mRNA轉(zhuǎn)錄成為DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(complementaryDNA)。實(shí)際上，是一種RNA依賴的DNA聚合酶。來源RNA腫瘤病毒。最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）和鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶（avianmyeloblastosisvirus,M-MLV）AMV的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組成。,.,聚合酶活性和RNaseH活性。RNaseH：經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以53或35方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。,RNaseH,RNA,DNA,.,逆轉(zhuǎn)錄酶的用途合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。,RT-PCR用的模板克隆某個(gè)基因時(shí)，用其mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。,mRNA5,AAAAAA,TTTTTT,3,5,.,DNA修飾酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶T4多核苷酸激酶堿性磷酸酶,細(xì)菌性堿性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase，BAP從大腸桿菌中分離出來。具有抗熱性。,堿性磷酸酶,小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。SDS中加熱68可完全失活。,.,堿性磷酸酶的特性：催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。,堿性磷酸酶,.,Hind酶切,5AAGCTTTTCGAA5,堿性磷酸酶,易載體自連,堿性磷酸酶的功能,防止線性化的載體份子自我連接,.,外源DNA,連接酶,轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù),.,基因工程載體,.,基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增和表達(dá)，而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)制，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來實(shí)現(xiàn)。,.,分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)multiplecloningsites，MCS）。有適合的標(biāo)記，易于選擇。有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等。,載體需要滿足的條件,.,載體分類根據(jù)功能分：克隆載體:克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體:用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體:把一個(gè)基因插入到染色體組中根據(jù)來源：質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體,.,質(zhì)粒載體,.,質(zhì)粒載體（plasimidvectors）,1、質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性2、質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹,.,1.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性,（1）質(zhì)粒是一種廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的能自主的復(fù)制,的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。目前對細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。,.,質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。質(zhì)粒的存在形式：有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋3種。,雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）,開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）,線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）,.,質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型,質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳模式圖,L:松弛線性的DNA,松弛開環(huán)的OC構(gòu)型,超螺旋的SC構(gòu)型,.,作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)等部分。,.,多克隆位點(diǎn)功能：用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成。特點(diǎn)：每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)應(yīng)該在整個(gè)載體中是唯一的。,選擇標(biāo)記基因：在基因工程中的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌）的抗性基因。功能：通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選擇得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。,.,.,-互補(bǔ)(alpha-complementation)大腸桿菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的-片段和-片段分開時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶-片段的LacZ基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中。在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中只能編碼產(chǎn)生該酶的片段。這樣一來，含有功能性完整的LacZ基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的-片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被稱為是alpha-complementation。,.,所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物X-Gal和誘導(dǎo)物IPTG的平板上分辨出來。因?yàn)檫@類菌落中釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個(gè)菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別。,.,互補(bǔ)顯色反應(yīng),.,pBR322質(zhì)粒載體“P”表示是一種質(zhì)粒；“BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實(shí)驗(yàn)編號。,pBR3224363,.,.,.,加反應(yīng)液,Amp,Tet+Amp,連接,pBR3224363,.,pUC質(zhì)粒載體,在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。,.,.,pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn):第一，具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因。所編碼的-肽鏈可參與-互補(bǔ)作用，用X-gal顯色對重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。第二，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段。方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。,.,穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。,.,.,.,酵母ARS,ARS(autonomouslyreplicatingsequence自主復(fù)制序列)-染色體自主復(fù)制序列,是從酵母中克隆的真核細(xì)胞DNA復(fù)制起點(diǎn)序列。酵母每條染色體由多個(gè)復(fù)制子組成,復(fù)制子平均長度為36kb。整個(gè)基因組約由400多個(gè)復(fù)制子組成。,.,B1,B2,B3,A元件決定哪一段DNA序列作為復(fù)制起始位點(diǎn)，B元件可以增加復(fù)制起始位點(diǎn)的效率。,可能參與DNA雙鏈的解旋,.,.,酵母整合質(zhì)粒(YIps),酵母整合質(zhì)粒(YIps)：細(xì)菌質(zhì)粒含有一個(gè)酵母基因。是在pBR322的基礎(chǔ)上插入了一個(gè)URA3基因，這個(gè)基因編碼乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶，可以作為選擇標(biāo)記。YIp不能像質(zhì)粒一樣復(fù)制，其復(fù)制依賴于整合到酵母的染色體上。,URA3,AMPr,.,酵母附加質(zhì)粒(YEps),YEps可以含有完整的2m質(zhì)粒，也可以只含有2m質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)；因?yàn)樵谳d體中作為選擇標(biāo)記的基因與突變體主染色體DNA同源性很高，可以獨(dú)立的復(fù)制也可以整合到酵母的染色體內(nèi)。,來自于2m質(zhì)粒的載體稱為酵母附加載體或者YEps。,.,YEp克隆載體（酵母游離型質(zhì)粒）2m質(zhì)粒的oriEcoR酶切pBR322質(zhì)粒酵母染色體URA3基因Hind酶切YEp24（圖3-11）,.,特征（1）保留了pBR322的和篩選大腸桿菌克隆子（2）含URA3標(biāo)記篩選酵母菌克隆子（3）URA3基因補(bǔ)償酵母菌ura3突變優(yōu)點(diǎn)（1）是一種穿梭質(zhì)粒，可在酵母菌和大腸桿菌中復(fù)制（2）轉(zhuǎn)化率高，1gDNA可獲得約104105個(gè)克隆子（3）穩(wěn)定高拷貝復(fù)制故可用酵母菌高水平表達(dá)外源目的基因,.,含有酵母的篩選標(biāo)記ura3和DNA的自主復(fù)制序列ARS在真核細(xì)胞中獨(dú)立自主的復(fù)制，拷貝數(shù)高但不穩(wěn)定。,酵母復(fù)制質(zhì)粒（YRp）,.,在復(fù)制質(zhì)粒中再插入酵母著絲粒(centromer)的一個(gè)DNA片段(CEN)，幫助染色體能等量地分配到子代細(xì)胞中。所以，含有CEN序列的質(zhì)粒也將以同樣的機(jī)制穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中，并保證了穩(wěn)定質(zhì)粒在子代細(xì)胞中的等量分布。,酵母穩(wěn)定質(zhì)粒(YCp),URA3,AMPr,ARS,CEN,AMPr,ARS,URA3,CEN,.,酵母菌穿梭質(zhì)粒特性,.,.,噬菌體載體,.,噬菌體的生活周期：,.,一、噬菌體克隆載體,（一）噬菌體性質(zhì)DNA+外殼蛋白1、DNA(48.5kb)噬菌體中：線性宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn)),.,.,右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的調(diào)控因子、與DNA復(fù)制及裂解宿主菌有關(guān)的基因，這個(gè)區(qū)域約長12kb。,左側(cè)區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個(gè)成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長約20kb。,中間區(qū)域約長18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會(huì)影響噬菌體裂解生長的能力。,.,DNA基因結(jié)構(gòu),B2區(qū)和重組基因區(qū)是噬菌體進(jìn)入裂解周期的非必需區(qū)（15kb，約占噬菌體DNA的1/3），可將該區(qū)缺失或用外源DNA片段取代，對噬菌體的感染和生長都不會(huì)造成影響。60%區(qū)域?yàn)榱呀馍L所必需。,cI基因：溶源過程控制基因,.,噬菌體的缺陷：,基因組太大（49kb）；酶切點(diǎn)太多:有5個(gè)BamH位點(diǎn)，6個(gè)Bg位點(diǎn)5個(gè)EcoR位點(diǎn)。野生型只能接納一定長度的DNA。,.,構(gòu)建噬菌體載體的基本原理,切去非必須區(qū)段，在切去的同時(shí)，加載目的基因（2.5kb或更大）；去掉太多的酶位點(diǎn)，每種酶只留1-2個(gè)切口；增加標(biāo)記基因:噬菌體重組體分子不具抗生素抗性選擇標(biāo)記，主要是依據(jù)X-gal-IPTG顯色反應(yīng)來篩選重組子和噬菌斑的形態(tài)學(xué)特征。,.,按照這一基本原理構(gòu)建的噬菌體的派生載體，可以歸納成兩種不同的類型：插入型載體（insertionvectors），只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。替換型載體（rePlacementvectors），具有成對的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。噬菌體載體相對于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構(gòu)建。,.,.,2.組裝,1.連接,3.侵染,Why?,.,由于噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%105%左右的DNA，要求載體DNA和外源DNA長度之和在3953kb之間。插入式載體可攜帶的外源DNA片段較替換式為小。,.,插入型載體,gt10載體,替換了一段來自434噬菌體的片段imm434，其中基因c內(nèi)有一個(gè)EcoR位點(diǎn)。,.,置換型載體,EMBL3,在填充片段兩端帶有對稱的多克隆位點(diǎn),.,柯斯質(zhì)粒載體cosmidvectors,.,一類由人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。,柯斯質(zhì)粒載體cosmidvectors,“cosmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點(diǎn)（cos）的質(zhì)粒，又稱其為粘粒載體。,.,人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。,粘粒載體cosmid,.,能容納大片段（45kb）的小分子（4kb6kb）載體。組成：質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)，抗性基因，多克隆位點(diǎn)，已連接的cos位點(diǎn)。,.,具有噬菌體的特性：,cosmidvector的特點(diǎn),克隆外源DNA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。,在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌）。,具有質(zhì)粒載體的特性方便選擇高容量的克隆能力：45kb（最少不能低于30kb）。,.,凡具有cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要其長度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)粒可像噬菌體一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。,.,柯斯克隆理論依據(jù)是:,1）在線性噬菌體DNA分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列（cos位點(diǎn))。2）在噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出由數(shù)百個(gè)DNA拷貝組成的多連體分子。在此種分子中，前后兩個(gè)DNA基因組之間都是通過cos位點(diǎn)連接起來的。3）噬菌體具有的一種位點(diǎn)特異的切割體系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter體系，能識別兩個(gè)相距適宜的cos位點(diǎn)(38-45kb)，將多連體分子切割成單位長度的片段，并將它們包裝到噬菌體頭部中去。,.,2020/4/27,104,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,.,.,人工染色體載體,.,人工染色體載體,人工染色體載體（artificialchromosomevecter):又叫大分子DNA克隆載體，利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。,.,（1）自主復(fù)制序列（ARS）（autonomousreplicatingsequence）DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ori）,染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件：,（2）著絲粒（centromere，cen）,（3）端粒（telomeres，tel）,.,.,YAC的組成結(jié)構(gòu),3.,.,5.YAC載體的選擇標(biāo)記及篩選標(biāo)記,選擇標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型基因,篩選標(biāo)記：SUP4,宿主酵母菌：trp-和ura-,插入失活選擇：,SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。,（赭石突變抑制基因：UAA）,ade2-1,.,轉(zhuǎn)化,Ura-/Tra-,YAC工作原理,4.,.,基因克隆的方法,.,基因的分離,基因克?。壕褪抢肈NA重組技術(shù)及其它相關(guān)技術(shù)，獲得目的（外源）基因（DNA片段）并插入適當(dāng)?shù)妮d體DNA分子中，并能自我“復(fù)制”，獲得大量目的基因（DNA片段）的過程。,.,目的基因的制備:構(gòu)建基因組文庫構(gòu)建cDNA基因文庫利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)基因的化學(xué)合成,.,基因文庫,基因文庫基因組文庫cDNA文庫基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構(gòu)建，基因組序列分析，基因在染色體上的定位，基因組中基因的結(jié)構(gòu)和組織形式等。cDNA文庫：來源于細(xì)胞表達(dá)出的RNA，反映基因組表達(dá)的基因序列信息，用于研究特定細(xì)胞中基因的表達(dá)狀態(tài)和表達(dá)基因的功能等。,.,.,基因組文庫構(gòu)建,用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲存于一個(gè)受體菌的群體，即構(gòu)成了這種生物的基因組文庫。,.,文庫能夠覆蓋整個(gè)基因組；插入的片段比較大；文庫比較穩(wěn)定，且容易保存和操作。,基因組文庫必須符合的基本條件,.,基因組文庫的大?。篘=ln(1-P)/ln(1-f)N：文庫必需的克隆數(shù)P：文庫中目的DNA片段的出現(xiàn)概率f：插入片段大小/全基因組大小的比值,.,期望值為0.99，插入片斷為20kb的E.coli(4.6106bp)和human(3109bp)基因組的克隆數(shù)的計(jì)算NE.coli=1.1103,ln(1-0.99),ln1-(2104/4.6106),Nhuman=6.9105,ln(1-0.99),ln1-(2104/3109),這個(gè)例子說明用質(zhì)粒載體（插入片斷5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫，只需要幾千個(gè)克隆；而真核生物則需要更大承載能力的載體。,.,.,有一些序列不能被克隆Example:1.序列缺乏酶切位點(diǎn);2.目的基因包容在一個(gè)其大小范圍超出載體承載能力的DNA片段上。,.,植物基因組文庫構(gòu)建的基本步驟：大片段DNA克隆載體的準(zhǔn)備；大分子質(zhì)量的植物基因組DNA制備；大片段DNA分子的部分酶切；載體與外源片段的連接；載體的遺傳轉(zhuǎn)化。,.,載體的選擇,根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體構(gòu)建DNA文庫。,載體PlasmidphagecosmidBACYAC插入片斷(kb)523453501000,.,利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫,該法簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。,.,利用噬菌體構(gòu)建基因組文庫,.,利用考斯質(zhì)粒構(gòu)建基因組文庫,.,利用YAC構(gòu)建基因組文庫,.,cDNA文庫,cDNA文庫(completementDNALibrary)：某生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部或部分mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段，分別與載體重組而存在于一種受體的群體，即cDNA基因(部分)文庫。,.,基因組文庫包含該生物基因組DNA全部的序列；是具有生物種屬特異性的。cDNA文庫已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA；具有組織細(xì)胞特異性。,.,cDNA文庫的構(gòu)建,載體cDNA片段的制備分離細(xì)胞總RNA；以mRNA為模板，合成cDNA第一鏈；雙鏈cDNA的合成。,.,mRNA純化的方法：以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效。原理：利用mRNA3末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫。,.,洗脫rRNA和tRNA,收集洗脫下來的mRNA,用纖維素柱純化mRNA的流程示意圖,.,.,以已知序列為基礎(chǔ)的克隆方法,獲取基因序列的途徑：從文獻(xiàn)中查取,EMBL:設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基因庫網(wǎng)址:http:/www.ebiac.uk/ebi-home.htmlGenbank:設(shè)在美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫網(wǎng)址:/web/search/index.html,.,.,.,測序,部分氨基酸序列,簡并引物部分cDNA作為探針,基因組文庫,cDNA文庫,目的片段,RACE-PCR,目的片段,部分RNA,.,RACE-PCR（末端快速擴(kuò)增技術(shù)）,使用此種方法的目的？在什么情況下用？基于什么技術(shù)（方法）？基本過程（基本原理）？,.,RACE（RapidamplificationofcDNAends）cDNA末端的快速擴(kuò)增技術(shù)，是以mRNA為模板合成cDNA第一條