蛋白質(zhì)的研究方法與原理

.,第十章蛋白質(zhì)的研究方法與原理,.,第一節(jié)概述,.,蛋白質(zhì)的分離純化包括以下過程：1.破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)抽提出來；2.將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級沉淀下來;（鹽析法或有機(jī)溶劑法）3.應(yīng)用層析法或電泳法使它們各自分開；4.蛋白質(zhì)結(jié)晶；5.蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測定。,直接從生物組織中提純蛋白,.,制備過程中注意事項：要求自始至終保持在天然狀態(tài)避免一切過激因素-如過酸或過堿，高溫，重金屬等的影響。2.通常都在低溫條件下操作。3.盡可能使樣品中蛋白質(zhì)的濃度維持在較高水平。,.,第二節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù),.,一、蛋白質(zhì)沉淀與結(jié)晶,.,（一）鹽析法概念：將中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，破壞水化膜和電荷而使蛋白質(zhì)沉淀，叫鹽析。各種蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度及PH不同，加入不同濃度的中性鹽可使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀出來。優(yōu)點：操作簡便對易變性的蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，適用范圍十分廣泛。缺點：分辨能力差，純化倍數(shù)低,.,（1）鹽的種類對同一種Pr而言，價數(shù)愈高的鹽離子，鹽析能力也愈強(qiáng):PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2ACCLNO3-Br-I-CNS-K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+常用的中性鹽有如硫酸鹽、磷酸鹽等。,.,硫酸銨（常用鹽析劑）優(yōu)點：鹽析能力較強(qiáng)具有較高的溶解度較低的溶解度溫度系數(shù)價格低廉不產(chǎn)生副作用。缺點：緩沖能力較差PH難控制,.,（2）PH和溫度S。代表蛋白質(zhì)在無機(jī)鹽溶液中的溶解度除取決于Pr的種類，還受PH及溫度影響:PH=PI時，S。的數(shù)值極小S。隨溫度增加而減低。鹽析過程中，若增高溫度，有助于Pr的析出。,.,（3）蛋白質(zhì)濃度Pr較高，在較低無機(jī)鹽濃度時,蛋白質(zhì)便開始析出，鹽析界限比較寬。Pr較低，需要無機(jī)鹽的濃度也高，即鹽析界限變窄。,.,1.基本原理（1）在PI附近，Pr主要以中性離子形式存在。此時若添加有機(jī)溶劑，由于有機(jī)溶劑可使溶液電離常數(shù)減小，增強(qiáng)了中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來。（2）有機(jī)溶劑本身的水合作用會破壞Pr表面的水合層，也促使Pr變得不穩(wěn)定而聚集析出.常用的有機(jī)溶劑：乙醇和丙酮,（二）有機(jī)溶劑沉淀法分辨力比鹽析方法高，提純效果好,.,（三）選擇性沉淀法,選擇一定的條件使其它蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離方法。例如，將提取液加熱至一定溫度并維持一段時間，是某些不耐熱的蛋白質(zhì)變性沉淀等。應(yīng)用選擇星辰殿，徐實現(xiàn)對系統(tǒng)中需除去的及欲提純的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)均有較全面的了解。,.,（四）蛋白質(zhì)結(jié)晶,蛋白質(zhì)結(jié)晶即是溶液中的蛋白質(zhì)由隨機(jī)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛幸?guī)則排列狀態(tài)的固體，常用語分析研究其結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)晶是一個有序化過程，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)，能夠形成一定大小的晶核，溶液中的分子失去自由運動的能量，不斷地結(jié)合到形成的晶核上，長成適合于X線衍射分析的晶體。,.,二、離心技術(shù)分離蛋白質(zhì),離心技術(shù)是利用物體告訴旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其它顆粒分離之目的。,.,三、層析技術(shù)分離純化蛋白質(zhì),最基本的特征：固定相流動相,層析技術(shù)（chromatography）又稱色譜技術(shù)，是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。,各種物質(zhì)得以分離的最基本原因：就在于它們在這兩個相之間具有不同的分配系數(shù).兩相作相對運動時，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次的分配，即使它們的分配系數(shù)只有微小的差異，通過這個過程也能得到最大的分離效果。,.,氣相層析按兩相狀態(tài)來分液相層析吸附層析分配層析離子交換層析按層析機(jī)理來分凝膠排阻層析親和層析柱層析按操作方式來分薄層層析紙層析,層析技術(shù)的種類,.,（一）凝膠過濾層析又稱分子篩或凝膠過濾（gelfiltration）原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。當(dāng)分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時，直徑大于孔徑的分子將不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較小的分子進(jìn)入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱內(nèi)保留時間就比較長。這樣，較大的分子被先洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達(dá)到相互分離的目的。,.,離子交換層析法*原理：陰（陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相）填充在層析柱內(nèi)，由于陰（陽）離子交換樹脂顆粒上帶正（負(fù)）電荷，能吸引溶液中的陰（陽）離子。然后再用含陰（陽）離子的溶液洗柱。含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來，增加陰離子濃度，含負(fù)電量多的蛋白質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。,.,親和層析法原理：利用生物高分子具有能和某些相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性。如，酶的活性部位能和底物抑制劑輔助因子專一性地結(jié)合,改變條件又能使這種結(jié)合解除.酶的變構(gòu)中心與變構(gòu)因子（或稱效應(yīng)物）之間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結(jié)合蛋白與結(jié)合物之間。這些被作用的對象物質(zhì)稱之為配基（ligand)。,.,高效液相層析法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）又稱“高壓液相色譜，是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。,.,四、電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì),電泳（electrophoresis）是指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷相反方向電極移動的現(xiàn)象。,.,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS(十二烷基硫酸鈉)是陰離子型去污劑(Sodiumdodecylsulfate,SDS)Qu=（遷移率）6ru與Q、r有關(guān)若蛋白質(zhì)分子帶有足夠的電荷，在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，由于分子篩效應(yīng)，u僅取決于分子的大小。因此SDS一凝膠電泳可以按蛋白質(zhì)分子大小的不同將其分開。這時，若以分子量的對數(shù)（logM）對相對于染料前沿的遷移率（Rf）作圖，呈現(xiàn)線性關(guān)系。,.,這種關(guān)系，對一種膠濃度時，只適用于一定的分子量范圍：5膠濃度時，適用于分子量6200萬的區(qū)間；10膠濃度時，適用于分子量1.67萬的區(qū)間；15膠濃度時，適用于分子量1.24.5萬的區(qū)間。,.,聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜,.,等電聚焦電泳（isoelectricfocusing,IEF）是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)。利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個pH梯度。pH梯度制作利用的兩性電解質(zhì)（ampholyte，商品名為ampholine），是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度。凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等,.,Pr分子有一定的PI，它處在一個由陽極到陰極梯度逐漸增加的介質(zhì)中，并通過以直流電時，它便“聚焦”在與其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白質(zhì)泳動后形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。,.,優(yōu)點：1.有很高的分辨率；2.可以區(qū)分等電點只有0.01pH單位差異的蛋白質(zhì)；3.根據(jù)其所在位置還能夠測定蛋白質(zhì)的分子量；4.對很稀的樣品，最后達(dá)到高度的濃縮。,.,雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳-PI第二向采用SDS一凝膠電泳-分子量由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的等電點和分子量兩種完全不同的特一性來進(jìn)行分離，因此具有非常高的分辨率可同時分析幾千上萬個蛋白，分辨率高，分離度好。是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。,.,雙向PAGE,.,具有以下特征的蛋白質(zhì)在二維電泳中還很難被檢測到：等電點（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白質(zhì)；分子質(zhì)量很大的蛋白質(zhì)，比如大于l00kDa的蛋白質(zhì)就比實際的少了，而大于150kDa的蛋白質(zhì)就幾乎完全探測不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些大蛋白質(zhì)都能清楚地被觀察到；疏水性蛋白質(zhì)。,雙向電泳技術(shù)缺點,.,高效毛細(xì)管電泳,.,1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）,毛細(xì)管區(qū)帶電泳也稱為自由溶液溶液區(qū)帶電泳,這種電泳模式的特征是整個系統(tǒng)都用同一種緩沖溶液充滿，帶電粒子的遷移速度依賴物質(zhì)的荷/質(zhì)比差異。荷/質(zhì)比越大，泳動越快。,.,2.毛細(xì)管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）,將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。,.,3.膠束電動毛細(xì)管色譜（Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC）,緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長；可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。,在電場力的作用下，膠束在柱中移動。,.,4.毛細(xì)管等電聚焦電泳（Capillaryisoelectricfocusing，CIEF）,是根據(jù)等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；CIEF是在毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)，當(dāng)施加直流電壓（68V）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；此法可用于測定蛋白質(zhì)的等電點、純度鑒定、不同變異體的分析等。,.,5.毛細(xì)管等速電泳（Capillaryisotachophoresis，CITP）,將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細(xì)管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。負(fù)離子分析時，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽極前進(jìn)，逐漸形成各自獨立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣，陽極檢測。,.,6.親和毛細(xì)管電泳（affinitycapillaryelectrophoresis,ACE）,是毛細(xì)管內(nèi)壁涂布或在凝膠中加入親和配基，以親和力的不同達(dá)到分離目的。,.,7.毛細(xì)管電動色譜（Capillaryelectrokineticchromatography，CEC）,在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲泵”取代機(jī)械泵，試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動色譜過程。,.,第三節(jié)蛋白質(zhì)含量的測定方法,.,測定蛋白質(zhì)含量的方法較多基本上都是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性建立起來的。,.,目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法:定氮法,雙縮脲法(Biuret法)，F(xiàn)olin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法.另外還有一種近十年才普遍使用起來的新測定方法,考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法).其中Bradford法和Lowry法靈敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比Biuret法高100倍以上.凱氏定氮法比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。,.,一、凱氏定氮法,凱氏定氮法的原理基于蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，通過測定樣品中氮元素的量來計算出蛋白質(zhì)的含量。,基本操作過程：,用硫酸對樣品加熱消化，蛋白質(zhì)被硫酸氧化成CO2和H2O，氮元素被還原成NH3，并形成(NH4)2SO4；加入強(qiáng)堿，使硫酸銨釋放出NH3，并將NH3收集在無機(jī)酸液中；用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液滴定，確定NH3量；根據(jù)量確定樣品含氮量，進(jìn)而求得樣品中的蛋白質(zhì)含量。,.,(1)H2NCH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH3(2)2NH3+H2SO4(NH4)2SO4(3)(NH4)SO4+2NaOH2H2O+Na2SO4+2NH3,此法靈敏度低,適用于0.3-3.0g氮,誤差為2%,最大缺點是受樣品中非蛋白質(zhì)含氮化合物的影響。測定前需用蛋白質(zhì)沉淀劑沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。,優(yōu)點凱氏定氮法由于具有測定準(zhǔn)確度高，可測定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點，因而被公認(rèn)為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。,1、酒精燈2、蒸汽發(fā)生器3、長玻璃管4、橡皮管5、小玻杯6、棒狀玻璃塞7、反應(yīng)室8、反應(yīng)室外殼9、夾子10、反應(yīng)室中插管11、冷凝管12、錐形瓶13、石棉網(wǎng),.,二、紫外吸收法,蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系符合朗伯-比耳定律，因此，可用比色法直接測定蛋白質(zhì)濃度。,.,在測定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白質(zhì)的濃度：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45A280nm0.74A260nm上式中的OD280nm是蛋白質(zhì)溶液在280nm下測得的光密度，OD260nm是蛋白質(zhì)溶液在260nm下測得的光密度。,.,優(yōu)點：1.快速；2.對蛋白質(zhì)無破壞性。缺點：1.不是嚴(yán)格的定量方法。因為此法是根據(jù)酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）殘基的強(qiáng)吸收值來測定的，不同的蛋白質(zhì)具有不同的消光系數(shù)。另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中不含Tyr、Phe或Trp殘基時，該方法就不能檢出蛋白。（此法用于測粗提總蛋白濃度較為適宜）2.核酸可引起強(qiáng)烈干擾。,.,（一）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）,考馬斯亮藍(lán)G-250法是比色法與色素法相結(jié)合的復(fù)合方法。考馬斯亮藍(lán)G-250是一種染料，在游離狀態(tài)下呈棕紅色，在465nm下有最大吸收峰；當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈青藍(lán)色。在一定范圍內(nèi)，也就是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量在01000g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，所以可用比色法測定。,.,優(yōu)點是：（1）靈敏度高：蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此蛋白質(zhì)測定的靈敏度較高，最低檢出量為1ug蛋白質(zhì)。據(jù)估計比Lowry法約高四倍。（2）測定快速、簡便：染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，大約只需2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時內(nèi)是穩(wěn)定的。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。,.,（二）lowry法,在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的Tyr和Phe殘基還原，產(chǎn)生深蘭色的鉬蘭和鎢蘭的混合物。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。在680nm處測定樣品吸光值，確定其蛋白質(zhì)含量。,.,優(yōu)點：操作簡單、迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的設(shè)備，靈敏度比較高。缺點：Folin-酚試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中的酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法受蛋白質(zhì)特異性影響，蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸含量不同使得顯色強(qiáng)度也不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線。此方法的初步顯色是雙縮脲反應(yīng)，因此，凡是干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)（因素）都會干擾Folin-酚反應(yīng)。,.,第四節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法,.,一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析,步驟：分離蛋白質(zhì)樣品必需純（97%以上）。測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，產(chǎn)生單一多肽鏈。分離純化單一多肽鏈。測定多肽鏈的氨基酸組成。多肽鏈斷裂可采用特異的酶或化學(xué)試劑將多肽樣品斷裂成肽碎片，并將其分離開來。對每一肽段進(jìn)行測序。確定肽段在多肽鏈中的次序。確定蛋白質(zhì)分子中二硫鍵及酰胺基的位置以及磷酸化、糖基化位點。,.,（一）測序前的準(zhǔn)備工作,1.多肽鏈氨基端和羧基端分析,2.多肽鏈氨基酸組成分析,3.多肽鏈有限水解為若干個肽段,N-端：丹酰氯丹酰肽-層析分離鑒定C-端：肼解法，羧肽酶法,高效液相色譜測定氨基酸的種類和含量,采用特異性的酶或化學(xué)試劑將單一多肽鏈有限水解為具有部分重疊的若干個肽段。,.,（二）多肽鏈氨基酸序列測定,1.Edman降解法,Edman降解法：是肽鏈或蛋白質(zhì)中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲爾埃德曼（PehrEdman）首先創(chuàng)立。,.,原理：用異硫氰酸苯酯（PITC）與待分析多肽的N-端氨基在堿性條件下反應(yīng)，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸處理，關(guān)環(huán)，肽鏈N-端被選擇性地切斷，得到N-端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接著用有機(jī)溶劑將該衍生物萃取出來，酸作用下，該衍生物不穩(wěn)定，會繼續(xù)反應(yīng)，形成一個穩(wěn)定的苯基乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽鏈中的酰胺鍵不受影響。通過用HPLC或電泳法分析生成的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鑒定出是哪一個氨基酸。每反應(yīng)一次，結(jié)果是得到一個去掉N-端氨基酸殘基的多肽，剩下的肽鏈可以進(jìn)入下一個循環(huán)，繼續(xù)發(fā)生降解。,.,優(yōu)點：能夠可靠地測定肽鏈的30個左右氨基酸殘基序列，最多可以分析50-60個氨基酸殘基。在最好的條件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，缺點：由于Edman降解是以化學(xué)試劑對N-端氨基的修飾為基礎(chǔ)的，因此當(dāng)N-端被其他化學(xué)基團(tuán)所封閉時，就需要先去除這些基團(tuán)，然后才能進(jìn)行測序。此外，蛋白質(zhì)中含有半胱氨酸殘基時，有時兩個半胱氨酸殘基會發(fā)生二硫鍵交聯(lián)。這種情況下，需要先用過酸將二硫鍵氧化為SO3H，然后才能用Edman降解測定序列。,.,2.質(zhì)譜法,質(zhì)譜技術(shù)基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的氨基酸測序方法是根據(jù)質(zhì)譜技術(shù)測定多肽分子質(zhì)量的極高準(zhǔn)確性這一特點而設(shè)計的。,先測定某一肽段（如：A-B-C-D-E-F-G-）以及從C-末端或N-末端去除一個殘基的同一肽段（如：B-C-D-E-F-G-）各自的分子質(zhì)量，二者之差值即為末端殘基（A）的分子質(zhì)量。然后與20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的分子量進(jìn)行比較就可以確定末端氨基酸的本質(zhì)了。,測定時：,.,實際操作時：從質(zhì)譜上得到的是一系列的多肽片段，每對大小相近的片段之間僅僅相差一個氨基酸殘基。根據(jù)這一分子量差值的大小，較大肽段的末端殘基即可準(zhǔn)確判斷。換句話說，從獲得的一系列依次相差一個殘基的肽段的分子質(zhì)量中我們很快就可以確定最初樣品多肽的末端序列（從N一末端或C一末端開始）。,.,二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析,（一）X射線衍射晶體分析法,（二）核磁共振法,（三）圓二色譜法,（四）傅里葉變換紅外光譜法,（五）生物信息學(xué)預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu),.,（一）X射線衍射晶體分析法,.,X射線本質(zhì),X射線是一種短波長(0.00510nm)、高能量(2.51051.2102eV)的電磁波。它是原子內(nèi)層電子在高速運動電子流沖擊下，產(chǎn)生躍遷而發(fā)射的電磁輻射。,.,X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析基本原理,X射線衍射分析所依賴的基本原理是X射線衍射現(xiàn)象X射線衍射現(xiàn)象利用X射線的波長和晶體中原子的大小及原子間距同數(shù)量級的特性來分析晶體結(jié)構(gòu)。當(dāng)X射線入射到樣品晶體分子上時，分子上的每個原子使X射線發(fā)生散射，這些散射波之間相互疊加形成衍射圖形。衍射圖形能給出樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的許多資料，如原子間的距離、鍵角，分子的立體結(jié)構(gòu)、絕對構(gòu)型、原子和分子的堆積、有序或無序的排列等。,.,（二）核磁共振法,1946年美國斯坦福大學(xué)的F.Bloch和哈佛大學(xué)的E.M.Purcell兩個研究小組首次獨立觀察到核磁共振現(xiàn)象，為此他們兩人獲1952年諾貝爾物理獎。,1983年，瑞士科學(xué)家KurtWthrich教授實驗室首次運用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液構(gòu)象.發(fā)明了利用核磁共振(NMR)技術(shù)測定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的方法獲得了2002年度諾貝爾化學(xué)獎,.,NMR基本原理,核磁共振(NuclearMagneticResonance)，就是處于某個靜磁場中的自旋核系統(tǒng)受到相應(yīng)頻率的射頻磁場作用時,共振吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過程。,核磁共振波譜是測量原子核對射頻輻射(約4600MHz)的吸收，這種吸收只有在高磁場中才能產(chǎn)生。,核磁共振波譜儀,.,核磁共振法中幾個常用的參數(shù),化學(xué)位移耦合常數(shù)NOE（核歐沃豪斯效應(yīng)）信號強(qiáng)度譜峰面積弛豫時間,.,（1）化學(xué)位移,值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出現(xiàn)在低場；值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出現(xiàn)在高場。,.,（2）耦合常數(shù),核與核之間以價電子為媒介相互耦合引起譜線分裂的現(xiàn)象稱為自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相鄰兩峰之間的距離被稱為自旋自旋耦合常數(shù),用J表示。耦合常數(shù)用來表征兩核之間耦合作用的大小。,J耦合常數(shù)大小主要與連接兩個核的化學(xué)鍵數(shù)目有關(guān)，與影響標(biāo)量耦合核之間電子云分布的因素有關(guān)。,.,（3）NOE信號強(qiáng)度,當(dāng)分子內(nèi)有兩個空間距離小于0.5nm的原子核時，如果用雙共振法照射其中一個核，使干擾場的強(qiáng)度增加到剛使被干擾的譜線達(dá)到飽和，則另一個靠近的原子核的共振信號就會增加，這種現(xiàn)象稱核歐沃豪斯效應(yīng)（NOE）。,.,（4）譜峰面積,譜峰面積和分子中同一化學(xué)環(huán)境的原子核數(shù)目的多少成正比，因此峰面積的積分值可用來做定量分析的基礎(chǔ)。,.,（5）弛豫時間,原子核從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡排列狀態(tài)的過程叫弛豫過程。它所需的時間叫弛豫時間。自旋晶格弛豫：處于高能態(tài)的氫核，把能量轉(zhuǎn)給周圍的分子，回到低能態(tài)。自旋-自旋弛豫：兩個進(jìn)動頻率相同，進(jìn)動取向不同的磁性核，在一定距離內(nèi)時，它們相互交換能量，改變進(jìn)動方向。,.,二維核磁共振(2DNMR）,NMR可獲得分子內(nèi)各核的化學(xué)環(huán)境、核間的耦合關(guān)系、空間構(gòu)象等信息，但是當(dāng)分子較大的時候，由于裂分譜線間的重疊，因此在測定了同一種核的一維譜之后，需要了解兩種或三種不同核之間的聯(lián)系關(guān)系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2個頻率變量的函數(shù)，吸收峰對2個頻率變量作圖。1H-1HCOSY、1H-15NHSQC,.,核磁共振技術(shù)的應(yīng)用,早期核磁共振主要用于對核結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究，如測量核磁矩、電四極距、及核自旋等。后來廣泛應(yīng)用于分子組成和結(jié)構(gòu)分析，生物組織與活體組織分析，病理分析、醫(yī)療診斷、產(chǎn)品無損監(jiān)測等方面,.,（三）圓二色譜法,圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種簡單、快速而又較準(zhǔn)確的方法。圓二色譜是利用不對稱分子對左、右圓偏振光吸光率的不同來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。1969年，Greenfield用圓二色光譜數(shù)據(jù)估計了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。此后，關(guān)于利用圓二色譜研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的報道逐漸增多。,.,平面偏振光：指振動方向在同一平面內(nèi)的電磁波。圓偏振光：當(dāng)兩束振幅相等、互相垂直的偏振光位相相差1/4波長(90)時，其合成矢量繞光傳播方向旋轉(zhuǎn)前進(jìn)，朝著光源方向觀察時，電場矢量E末端軌跡為圓形，所以稱之為圓偏振光。電場矢量方向順時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為右圓偏振光，逆時針方向旋轉(zhuǎn)的則稱左圓偏振光。橢圓偏振光：振幅不等的左、右圓偏振光合成,.,圓二色性和圓二色譜,圓二色性：當(dāng)左、右圓偏振光進(jìn)入物質(zhì)時，光學(xué)活性物質(zhì)分子對它們的吸收不一樣，它們的差值就是圓二色性光學(xué)活性物質(zhì)分子對左、右圓偏振光的吸收不一樣，這種吸收差造成矢量振幅差，從介質(zhì)出來的光成為橢圓偏振光，用橢圓度或吸收差表示圓二色譜：指橢圓度(或比橢圓度等)與波長的關(guān)系，它在本質(zhì)上與旋光色散譜是一樣的。,.,圓二色譜的應(yīng)用,在分子生物學(xué)中，圓二色儀主要應(yīng)用于測定生物大分子的空間結(jié)構(gòu)。生物大分子很多是不對稱的，即光學(xué)活性分子，通過圓二色譜測定和計算能夠了解生物大分子在溶液狀態(tài)下的二級結(jié)構(gòu)。,.,蛋白質(zhì)或多肽是由氨基酸通過肽鍵連接而成的具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子，主要的光學(xué)活性生色基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵，另外，有的蛋白質(zhì)輔基對蛋白質(zhì)的圓二色性有影響。,肽鍵的不對稱性使得它總有光活性,蛋白質(zhì)的圓二色性主要由活性生色基團(tuán)及折疊結(jié)構(gòu)兩方面圓二色性的總和。根據(jù)電子躍遷能級能量的大小，蛋白質(zhì)的CD光譜分為三個波長范圍:1）250nm以下的遠(yuǎn)紫外光譜區(qū)，圓二色性主要由肽鍵的n*電子躍遷引起；遠(yuǎn)紫外CD主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的解析2）250300nm的近紫外光譜區(qū)，主要由側(cè)鏈芳香基團(tuán)的*電子躍遷引起；近紫外CD主要揭示蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)信息3）300700nm的紫外-可見光光譜區(qū)，主要由蛋白質(zhì)輔基等外在生色基團(tuán)引起。紫外-可見光CD主要用于輔基的偶合分析。,肽鍵是高度有規(guī)律排列的，其排列的方向性決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況。具有不同二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同。因此，根據(jù)所測得蛋白質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外CD譜，能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的信息，從而揭示蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構(gòu)。,-螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192nm有一正的譜帶，在222和208nm處表現(xiàn)出兩個負(fù)的特征肩峰譜帶；-折疊的CD光譜在216nm有一負(fù)譜帶，在185200nm有一正譜帶；-轉(zhuǎn)角在206nm附近有一正CD譜帶，而左手螺旋P2結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的位置有負(fù)的CD譜帶，如上圖和表所示。,CD數(shù)據(jù)擬合計算蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的方法基本原理是假設(shè)蛋白質(zhì)在波長處的CD信號()是蛋白質(zhì)中或多肽各種二級結(jié)構(gòu)組分及由芳香基團(tuán)引起的噪音的線性加，()=fi()i+noise。()i是第i個二級結(jié)構(gòu)成分的CD信號值，fi為第i個二級結(jié)構(gòu)成分的含量分?jǐn)?shù)，fi規(guī)定值為1；通過已知蛋白（或稱參考蛋白）二級結(jié)構(gòu)的圓二色數(shù)據(jù)庫，曲線擬合未知蛋白或多肽的圓二色數(shù)據(jù)，估算未知蛋白或多肽的二級結(jié)構(gòu)。,蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構(gòu)擬合計算方法中，主要采用多聚氨基酸為參考多肽。Greenfield等采用多聚L-lys作參考多肽，建立-螺旋、-折疊及無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)參考CD光譜曲線，采用單一波長法（208nm）計算出-螺旋含量后，然后假設(shè)不同的-折疊含量（X）值，并假設(shè)CD值是-螺旋含量(XH)、-折疊含量(X)無規(guī)卷曲(XR)三者貢獻(xiàn)值的加和，即：XH+X+XR=1,.,通過計算得到不同波長的()，得出計算曲線。假設(shè)一些不同的X值，分別求出它們相應(yīng)的計算曲線，找出與實驗曲線最接近的曲線，相應(yīng)于該最接近曲線的X及XR即認(rèn)為是該蛋白質(zhì)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)含量。,Examplefit:myoglobin(肌紅蛋白),Inthiscase:qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwithxa=80%,xb=0%xc=20%agreeswellwithstructure78%helix,22%coil,.,（四）傅里葉變換紅外光譜法,傅里葉變換紅外光譜法(Fouriertransforminfraredspectrometer,FTIS)主要是對其紅外光譜中酰胺I譜帶進(jìn)行分析。酰胺I譜帶為-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等不同結(jié)構(gòu)振動峰的加和帶，彼此重疊，在12601700cm-1范圍內(nèi)通常為一個不易分辨的寬譜帶。目前常應(yīng)用去卷積、微分等數(shù)學(xué)方法，使加合帶中處于不同波數(shù)的-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等各個吸收峰得以分辨。最后經(jīng)譜帶擬合，獲得各個吸收峰的信息。,.,（五）生物信息學(xué)預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu),1.同源模建法是預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要方法，通過對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析可以得到結(jié)論：任何兩種蛋白質(zhì)，如果兩者的序列同源部分超過30%，則它們具有相似的三維結(jié)構(gòu)，及他們的基本折疊相同，只是在非螺旋和非折疊區(qū)域的一些細(xì)節(jié)部分有所不同。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)的序列更保守，如果兩個蛋白質(zhì)的氨基酸序列有50%相同，那么約有90%的碳原子的位置偏差不超過3%。,.,主要步驟：識別模擬的模板；目標(biāo)序列和模板序列的排列；構(gòu)建模型；構(gòu)建非保守的loop區(qū)；安裝側(cè)鏈；模型修飾；結(jié)構(gòu)合理性評估,.,2.折疊識別法也稱穿線法（threading）。通過對已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，大量序列同源性較差的蛋白質(zhì)存在相同的折疊結(jié)構(gòu)。折疊識別法就是利用已知蛋白質(zhì)的折疊子為模板，尋找給定氨基酸序列可能采取的折疊類型，進(jìn)而進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測。,.,主要步驟：建立模板數(shù)據(jù)庫；構(gòu)造打分函數(shù)；比對；預(yù)測,.,3.從頭預(yù)測法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從頭預(yù)測是不依賴模板僅從氨基酸序列信息得到天然結(jié)構(gòu)。它的關(guān)鍵是正確定義能量函數(shù)、精確選用計算機(jī)搜索算法來尋找能量最低值。,.,第五節(jié)蛋白質(zhì)功能分析方法,.,一、酵母雙雜交技術(shù),利用雜交基因通過激活報告基因的表達(dá)，探測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。,.,.,酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報告基因的表達(dá)探測蛋白蛋白的相互作用。主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體;b含Transcription-activatingdomain的載體。1）兩種蛋白之間是否有相互作用2）尋找一種蛋白可能的相互作用蛋白,應(yīng)用,.,二、噬菌體展示技術(shù),.,三、表面等離子共振技術(shù),.,四、蛋白質(zhì)芯片技術(shù),.,蛋白質(zhì)芯片,又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強(qiáng)度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。,.,（一）蛋白質(zhì)芯片的分類,1.根據(jù)應(yīng)用分類:蛋白檢測芯片-將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用于識別復(fù)雜生物樣品中的目標(biāo)蛋白/多肽。根據(jù)檢測方法,不同蛋白質(zhì)檢測芯片又可進(jìn)一步分為正相蛋白質(zhì)檢測芯片和反相蛋白質(zhì)檢測芯片。,蛋白功能芯片-天然蛋白點加在基片上，了解體系中哪種蛋白能與已知的某種蛋白結(jié)合，用于天然蛋白活性及分子親和性研究。,.,2.根據(jù)載體分類：普通玻璃載體芯片、微孔型芯片、多孔凝膠覆蓋芯片,3.由CiphergenBiosystems提出的化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片和生物型蛋白質(zhì)芯片。,.,蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用,臨床檢驗及環(huán)境毒物檢測所需的免疫檢測和酶活性分析高通量抗體篩選蛋白質(zhì)組學(xué)研究生物大分子間的相互作用蛋白質(zhì)和小分子間的相互作用藥物靶標(biāo)及其作用機(jī)理的研究疾病診斷食品中有毒有害物質(zhì)的分析、在毒理學(xué)及衛(wèi)生檢驗中的應(yīng)用,.,五、免疫印跡技術(shù),免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting），是檢測蛋白質(zhì)混合物中某種特定蛋白質(zhì)的定性方法，也可以用于確定同一種蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或同一種細(xì)胞不同條件下相對含量的半定量方法。免疫印跡也是利用抗原抗體特異反應(yīng)的原理。,免疫印跡技術(shù)（Westernblotting)分三個階段進(jìn)行。,.,第一階段：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE),第二階段：電轉(zhuǎn)移，將在凝膠中已經(jīng)分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到固相載體(PVDF膜）上，選用低電壓（100伏）和大電流（12