酚氯仿法提取DNA實(shí)驗(yàn)報告

酚氯仿法和試劑盒法提取DNA實(shí)驗(yàn)報告一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理：酚氯仿法：先從全血中分離白細(xì)胞，再通過蛋白酶K 消化，通過酚、氯仿的抽提,使DNA進(jìn)入水相與蛋白質(zhì)成分分開，在RNase作用下，降解RNA以純化DNA。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二鈉存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中晶SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜晶并使組織蛋白與DNA分離晶EDTA則抑制細(xì)胞中Dnase的活性而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸晶使DNA分子完整地分離出來。 氯仿-異戊醇溶液可以使核蛋白變性沉淀晶將核酸物質(zhì)萃取出來再向萃取液中加入適量乙醇晶可使DNA析出。氯仿異戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA純化研究中非常常用晶氯仿-異戊醇抽提的原理是晶氯仿可使蛋白質(zhì)變性并加速有機(jī)相與液相分層異戊醇有助于消除抽提過程中產(chǎn)生的氣泡。而DNA不溶于乙醇等有機(jī)溶劑晶因此可以通過乙醇沉淀來純化和濃縮DNA二、 實(shí)驗(yàn)用品試劑：1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0),0.5M EDTA（pH8.0），5M NaClTES（15mMTris,15mM EDTA，15mM NaCl）Tris飽和酚（PH8.0）氯仿/異戊醇（V/V=24/1）10SDS5mg/ml Protease K 70乙醇、無水乙醇TE緩沖液（pH8.0）：10mM Tris-Cl（PH8.0）1mM EDTA(PH8.0)10mg/mL 溴化乙錠（EB）耗材：儀器：低溫離心機(jī)、移液槍一套，低溫冰箱，恒溫水浴鍋、紫外分光光度計（Eppendorf）。三、 實(shí)驗(yàn)步驟4.1取血樣：實(shí)驗(yàn)人員相互取血樣5ml.（用品：采血管、采血針、無水乙醇、棉簽、橡皮管、廢液缸）4.2血液樣品的預(yù)處理：分取2ml 血樣加入到離心管A中用于酚氯仿法提取DNA。1) 破除RBC：用移液器將采血管中剩余的3ml血樣中的血凝塊取出轉(zhuǎn)移到組織勻漿器中研磨粉碎，再移入50ml 離心管B中，再加入5倍體積無菌水，顛倒混勻，冰上靜置十分鐘，用于試劑盒法提取DNA。同樣方法破除離心管A中的紅細(xì)胞。2）離心管A：4，3000rpm，離心10min，棄上清，留沉淀，重復(fù)低滲、離心處理一次。3）離心管A：加入30ml 生理鹽水，上下輕輕混勻以重新懸浮、洗滌WBC沉淀，4，3000rpm，離心10min，棄上清，留沉淀。轉(zhuǎn)移到離心管中。（注意盡可能將上清棄凈，同時不要丟失WBC沉淀）4）用Protease K消化WBC：在離心管中加入4ml TES，立即用移液器吹打，將細(xì)胞團(tuán)塊吹散。加入100%SDS 350 ul，5mg/ml Protease K 100ul，充分混勻，65消化6 h。試劑盒法提?。┫螂x心管B加入3倍體積的Buffer RBL 輕輕渦旋或顛倒混勻，3000rpm離心10min，小心棄上清，留沉淀。）向沉淀中加入400ul Buffer GR，并轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，混勻；在此基礎(chǔ)上加入40ulProteaseK，混勻；再加入400ul Buffer GL ，顛倒混勻，劇烈旋渦震蕩一分鐘。）用塑料膜密封離心管管口，放入恒溫箱中7010min，（延長孵育時間）至溶液清亮。）加入400ul無水乙醇，顛倒混勻，4，3000rpm，離心1 min。）將上步所得溶液加入到已裝入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column DL）中，8000g離心1min，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。）向吸附柱中加入500ul Buffer（使用前檢查是否加入無水乙醇），離心，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。）向吸附柱中加入500ul Buffer（使用前檢查是否加入無水乙醇），離心，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。）再次離心，棄廢液，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。）將吸附柱置于一個新的離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入，離心一分鐘，收集溶液，保存。酚氯仿法法提?。┫蟮募?xì)胞懸液中加入等體積的飽和酚，上下輕輕顛倒混勻，冰浴靜置，離心。）將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入等體積的飽和酚，上下輕輕顛倒混勻，冰浴靜置，離心。）將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇（體積比:），上下輕輕顛倒混勻，冰浴靜置，離心。）將上層水相轉(zhuǎn)移到一個小燒杯中，加