細(xì)胞計(jì)數(shù)方法------細(xì)胞計(jì)數(shù)板法

細(xì)胞計(jì)數(shù)法-細(xì)胞計(jì)數(shù)板法實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中的細(xì)胞均勻分布時(shí)，每毫升細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)可以通過測量一定體積懸液中的細(xì)胞數(shù)來換算。具體操作：1.將計(jì)數(shù)板和蓋板擦拭干凈，并將蓋板蓋在計(jì)數(shù)板上。2.吸出少量細(xì)胞懸液，滴在蓋板邊緣，使懸液充滿蓋板和計(jì)數(shù)板之間的空間，靜置3分鐘。注意蓋板下沒有氣泡，懸浮液不能流入側(cè)油箱。3.計(jì)算平板中四個(gè)細(xì)胞的總數(shù)，只計(jì)算左邊和上面的細(xì)胞。然后根據(jù)公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/毫升=四個(gè)大細(xì)胞總數(shù)/410個(gè)細(xì)胞/毫升(注意：當(dāng)有很多單元格時(shí)，可以從四個(gè)單元格中選擇一定數(shù)量的較小單元格。由于每個(gè)大單元格中有16個(gè)較小的單元格，因此可以計(jì)算左側(cè)和上方的單元格數(shù)，并計(jì)算每個(gè)較小單元格中的單元格數(shù)。平均值M，m16是每個(gè)單元的平均值。因此，細(xì)胞密度=1610個(gè)細(xì)胞/毫升)注意：公式除以4，因?yàn)橛?jì)算的是4個(gè)大單元格中的單元格數(shù)。公式乘以10，因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每個(gè)大細(xì)胞的體積為：1.0毫米(長)1.0毫米(寬)0.1毫米(高)=0.1毫米，1毫升=1000微升=1000毫米(注意：偶爾在顯微鏡下可以看到由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞群，這應(yīng)根據(jù)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)超過10%，這意味著分散不好，需要再次制備細(xì)胞懸液。)=細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用一、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板基本結(jié)構(gòu)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器是一種特殊的厚玻璃載玻片，有四個(gè)槽形成三個(gè)平臺。中間的平臺較寬，中間被一個(gè)短橫槽分成兩半。每一半都刻有一個(gè)小方格。每個(gè)正方形網(wǎng)格被分成九個(gè)大網(wǎng)格。中間的大網(wǎng)格用于計(jì)數(shù)，稱為計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)有兩個(gè)刻度：一是計(jì)數(shù)區(qū)分成16個(gè)大方塊(大方塊用三條線隔開)，每個(gè)大方塊分成25個(gè)小方塊；另一種是，一個(gè)計(jì)數(shù)被分成25個(gè)大方塊(大方塊由雙線分隔)，每個(gè)大方塊被分成16個(gè)小方塊。然而，無論計(jì)數(shù)區(qū)是什么樣的結(jié)構(gòu)，它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)區(qū)由400個(gè)小方塊組成。如果計(jì)數(shù)區(qū)的邊長為1毫米，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為1平方毫米，每個(gè)小方塊的面積為1/400平方毫米。蓋玻片蓋好后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1毫米，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1毫米3，每個(gè)小方塊的體積為1/4000毫米3。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先測定每個(gè)小方塊中的微生物數(shù)量，然后換算成每毫升菌液(或每克樣品)中的微生物細(xì)胞數(shù)量。二。細(xì)胞計(jì)數(shù)板-用途1.根據(jù)待測細(xì)菌懸液的濃度，加入無菌水適當(dāng)稀釋(斜面通常稀釋100倍)，以每細(xì)胞細(xì)菌數(shù)為度。2.取一塊干凈的細(xì)胞計(jì)數(shù)板，并在計(jì)數(shù)區(qū)蓋上一個(gè)蓋玻片。3.將細(xì)菌懸液搖勻，用滴管吸一點(diǎn)，從計(jì)數(shù)板中間平臺兩側(cè)的凹槽中沿蓋玻片下邊緣挑一小滴(不要太多)。讓細(xì)菌懸液充滿液體表面張力的計(jì)數(shù)區(qū)，不要產(chǎn)生氣泡，用吸水紙吸出從凹槽流出的多余細(xì)菌懸液。也可以將細(xì)菌懸液直接滴到計(jì)數(shù)區(qū)(不要用細(xì)菌懸液涂抹計(jì)數(shù)區(qū)兩側(cè)的平臺，以免蓋玻片后計(jì)數(shù)區(qū)的深度增加)，然后蓋上蓋玻片(不要產(chǎn)生氣泡)。4.靜置一會(huì)兒，讓細(xì)胞停留在計(jì)數(shù)板上，不要隨液體漂移。將細(xì)胞計(jì)數(shù)板放在顯微鏡載物臺上并夾緊。在低倍率鏡頭下找到計(jì)數(shù)區(qū)域后，切換高倍率鏡頭進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。因?yàn)榛罴?xì)胞的折射率與水的折射率相似，所以活細(xì)胞的折射率與水的折射率相似5.如果計(jì)數(shù)區(qū)由16個(gè)大方塊組成，根據(jù)對角線方向，計(jì)算左上角、左下角、右上角和右下角4個(gè)大方塊(即100個(gè)小方塊)中的細(xì)菌數(shù)量。如果是一個(gè)由25個(gè)大方塊組成的計(jì)數(shù)區(qū)，上述四個(gè)方塊的除數(shù)就特別大，需要對中心大方塊(即80個(gè)小方塊)中的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，對放在網(wǎng)格上的細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如果菌體位于一個(gè)大正方形的雙線上，則計(jì)數(shù)上一行，計(jì)數(shù)下一行，計(jì)數(shù)左一行，以減少誤差。也就是說，網(wǎng)格的上、左行上的單元被計(jì)數(shù)到網(wǎng)格中，網(wǎng)格的下、右行上的單元根據(jù)規(guī)則被計(jì)數(shù)到相應(yīng)的網(wǎng)格中。請參見下圖：即，該單元格中有3個(gè)計(jì)數(shù)單元格。6.對于出芽酵母，當(dāng)芽體達(dá)到母細(xì)胞一半大時(shí)，可以算作兩個(gè)菌體。對每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次(每個(gè)值不應(yīng)相差太多，否則應(yīng)重新操作)，并根據(jù)公式計(jì)算每毫升(g)細(xì)菌懸液中包含的細(xì)胞數(shù)。7.計(jì)數(shù)后，取下蓋玻片，用水沖洗細(xì)胞計(jì)數(shù)板，不要用硬物清洗或擦拭，以免損壞網(wǎng)格刻度。清洗后，自己或用吹風(fēng)機(jī)吹干，并儲存在盒子里。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)平板計(jì)數(shù)公式1.16格25格細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/毫升=100格細(xì)胞數(shù)/10040010000的稀釋倍數(shù)1.25格16格細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/毫升=80格細(xì)胞數(shù)/8040010000稀釋倍數(shù)4.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)誤差的主要來源是什么？我們應(yīng)該如何最小化誤差并努力提高準(zhǔn)確性？血細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差分別來自技術(shù)誤差和內(nèi)在誤差。其中，操作人員采血不順暢、設(shè)備操作和使用不當(dāng)、稀釋不準(zhǔn)確、細(xì)胞識別錯(cuò)誤等因素造成的誤差屬于技術(shù)誤差。然而，由不準(zhǔn)確和不精確的儀器(計(jì)數(shù)板、蓋子、吸管等)引起的誤差。)被稱為儀器誤差，由諸如細(xì)胞分布不均勻等因素引起的細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差屬于分布誤差或場誤差。儀器誤差和分布誤差統(tǒng)稱為固有誤差或系統(tǒng)誤差。通過標(biāo)準(zhǔn)化操作、提高熟練程度和校正儀器，可以避免或校正技術(shù)誤差和儀器誤差，但細(xì)胞分布誤差很難完全消除。因此，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的質(zhì)量控制一般需要以下措施。1.避免技術(shù)錯(cuò)誤并糾正儀器錯(cuò)誤(1)所用設(shè)備應(yīng)清潔干燥，計(jì)數(shù)板、血蓋片、微量移液器和刻度移液器的規(guī)格應(yīng)符合要求或予以校正。(1)計(jì)數(shù)板的標(biāo)識：計(jì)數(shù)室的臺面應(yīng)光滑透明，計(jì)數(shù)室的標(biāo)記清晰，標(biāo)記區(qū)域準(zhǔn)確。必要時(shí)，用經(jīng)過嚴(yán)格校正的目鏡測微計(jì)測量計(jì)數(shù)室的邊長和底面積，用測微計(jì)測量計(jì)數(shù)室的深度。美國國家標(biāo)準(zhǔn)局(NBS)規(guī)定，每個(gè)大方塊的邊長誤差應(yīng)小于1%，即10.01毫米，深度誤差應(yīng)小于2%，即0.10.002毫米。如果超過上述標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)將其丟棄。(2)血蓋應(yīng)具有一定的重量，平整、光滑、無裂紋、厚度均勻，可用卡尺多點(diǎn)測量(至少9點(diǎn))，不均勻在0.002毫米以內(nèi).必要時(shí)，平面平行度用于測量和評估，需要密集的平行直干涉條紋。最簡單的評估方法是將干凈的蓋板貼在干燥的平板玻璃上。如果它能被吸附一段時(shí)間而不脫落，它會(huì)在落下時(shí)以弧形旋轉(zhuǎn)，表明蓋板是平的且厚度均勻。同時(shí)，合格的蓋板放置在計(jì)數(shù)室表面后，在與支撐柱緊密接觸的位置可以看到彩虹。選定的封面與其他封面緊密重疊后，在掠光下觀察。如果你看到完整和平行的彩虹條紋，另一個(gè)封面的質(zhì)量也(3)嚴(yán)格操作，從消毒、采血、稀釋、灌裝池到計(jì)數(shù)都應(yīng)規(guī)范，尤其應(yīng)注意血樣稀釋和灌裝池應(yīng)充分混合，并防止劇烈休克破壞紅細(xì)胞。計(jì)數(shù)室必須一次充滿，以防止產(chǎn)生氣泡。待填充的細(xì)胞懸液的量不應(yīng)超過計(jì)數(shù)室的相對表面和血液覆蓋片之間的矩形邊緣。(4)報(bào)告法定計(jì)量單位。2.計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差的減少由于血細(xì)胞在注入計(jì)數(shù)室后的隨機(jī)分布或泊松分布引起的計(jì)數(shù)誤差稱為計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差，因?yàn)槲覀兛梢杂?jì)數(shù)的細(xì)胞分布范圍是有限的。減少這種誤差的有效方法是盡可能擴(kuò)大細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍和計(jì)數(shù)數(shù)量。通常，首先進(jìn)行誤差估計(jì)，然后確定計(jì)數(shù)所需的數(shù)量和計(jì)數(shù)范圍，只要誤差可以控制在允許的范圍內(nèi)。伯克森指出，當(dāng)使用相同的移液器和相同的側(cè)計(jì)數(shù)室來計(jì)數(shù)面積為0.2mm2的細(xì)胞數(shù)時(shí)，變異系數(shù)被控制在可接受的7%以內(nèi)。對于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)來說，由于紅細(xì)胞的數(shù)量很大，所以在計(jì)數(shù)室是“擁擠”的，這是從泊松公式推導(dǎo)出來的。為了將誤差控制在5%的變化范圍內(nèi)，在計(jì)數(shù)室中至少需要對400個(gè)紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，因此需要對紅細(xì)胞進(jìn)行五格計(jì)數(shù)。事實(shí)上，柏克森還通過實(shí)驗(yàn)證明，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)域誤差為s=0.92，小于理論誤差(泊松分布誤差)。3.當(dāng)排除異常標(biāo)本的干擾白細(xì)胞數(shù)在正常范圍內(nèi)時(shí)，其影響相對于紅細(xì)胞數(shù)可以忽略不計(jì)，但如果白細(xì)胞過高(100109/L)，則應(yīng)校正計(jì)數(shù)結(jié)果。方法是：實(shí)際紅細(xì)胞=計(jì)算紅細(xì)胞-白細(xì)胞。例如，當(dāng)紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為3.51012/升，白細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為100109/升時(shí)，患者的實(shí)際紅細(xì)胞數(shù)應(yīng)為3.41012/升.高倍鏡下計(jì)數(shù)時(shí)避免有核細(xì)胞。有核細(xì)胞體積大于正常紅細(xì)胞，中心無凹陷，無麥稈黃色折射。可以隱約看到細(xì)胞核。此外，急性重度貧血患者可提前大量釋放網(wǎng)織紅細(xì)胞，這也給紅細(xì)胞計(jì)數(shù)帶來一定的干擾，影響網(wǎng)織紅細(xì)胞的絕對值計(jì)算結(jié)果。校正方法需要討論。使用計(jì)數(shù)室對于微生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和許多需要使用細(xì)胞懸浮液的應(yīng)用，有必要確定細(xì)胞濃度。人們通?？梢杂梅止夤舛确y定懸浮細(xì)胞的密度，但是這種測定方法不能評估細(xì)胞的生存能力，也不能區(qū)分細(xì)胞類型。一種用于測定單位體積懸浮液中細(xì)胞數(shù)量的裝置稱為計(jì)數(shù)室。最廣泛使用的腔室類型被稱為血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，因?yàn)樗畛跏菫檫M(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)而設(shè)計(jì)的。為了準(zhǔn)備計(jì)數(shù)室，用透鏡紙仔細(xì)清潔鏡面拋光表面。蓋玻片也被清潔。安裝室的蓋玻片是特制的，比傳統(tǒng)顯微鏡的蓋玻片更厚，因?yàn)樯w玻片必須足夠重以克服一滴液體的表面張力。在將g放入細(xì)胞懸液之前，將蓋玻片放在計(jì)數(shù)表面上。用巴氏滅菌器或其他類型的移液管將懸浮液引入其中一個(gè)V形孔中。蓋玻片下的區(qū)域通過毛細(xì)作用填充。應(yīng)該引入足夠的液體，使鏡面剛好被覆蓋。然后將充電的計(jì)數(shù)室放置在顯微鏡載物臺上，并以低功率聚焦計(jì)數(shù)網(wǎng)格。由于計(jì)數(shù)室比傳統(tǒng)的載玻片厚得多，因此必須非常小心地使用更高功率的物鏡。如果用戶不小心，腔室或物鏡可能會(huì)損壞。在40倍(4倍物鏡)處可以看到標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上的一個(gè)完整網(wǎng)格，帶有紐鮑爾刻度。主要的