腫瘤基因治療的研究進(jìn)程及發(fā)展趨勢(shì)-郭曉明

免疫學(xué)概論課程論文腫瘤基因治療的研究進(jìn)程及發(fā)展趨勢(shì)姓 名： 郭冬陽 學(xué) 號(hào)： 200904123100* 學(xué) 院： 材料與化工學(xué)院 專業(yè)班級(jí)： 2009級(jí)生物工程（2）班 指導(dǎo)教師： 鄭育聲 分?jǐn)?shù)： 2012年12 月30 日摘要腫瘤的基因治療就是將一個(gè)治療基因“捆綁”在“病毒”上，隨后將這種載有治療基因的“病毒”感染腫瘤患者或腫瘤細(xì)胞，使治療基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而“摧毀”腫瘤細(xì)胞。這種腫瘤的治療技術(shù)已成為現(xiàn)代廣大腫瘤學(xué)者的研究熱點(diǎn)，其具有特異性、安全性、有效性的特點(diǎn)而受到越來越多的關(guān)注，而且許多實(shí)驗(yàn)及臨床研究取得了滿意的效果。本文將從腫瘤基因治療的方法、我國腫瘤基因治療的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)等方面進(jìn)行論述。關(guān)鍵詞：腫瘤；基因治療；研究進(jìn)展；發(fā)展趨勢(shì)基因治療是以改變遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)，需要將目的基因傳遞到細(xì)胞內(nèi)，這一過程必需載體的協(xié)助才能達(dá)到目的，因此載體在基因的轉(zhuǎn)移中擔(dān)任重要角色。隨著免疫學(xué)的發(fā)展和基因技術(shù)研究的不斷加深，結(jié)合病毒載體、免疫基因和轉(zhuǎn)基因等方法在腫瘤的基因治療中取得了許多成就，為腫瘤的治療展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。一、腫瘤基因治療11 腫瘤基因治療的策略（1）免疫基因治療，又稱細(xì)胞因子基因治療，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子基因，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫能力；（2）自殺基因治療，使肝癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)某些藥物前體的特異敏感性而被殺；（3）基因置換或補(bǔ)充，置換突變的基因或補(bǔ)充缺失的抑癌基因；（4）反義苷酸技術(shù)，用于抑制癌基因的表達(dá)。12 腫瘤基因治療基因工程的程序 首先取得所需要的基因即目的基因，將其同載體連接，再將經(jīng)過重組的環(huán)狀DNA即質(zhì)粒引入受體細(xì)胞，并使目的基因和載體上其他基因的性狀得以表達(dá)等幾個(gè)環(huán)節(jié)。（1）在內(nèi)切酶的作用下分離制備待克隆的DNA片段；（2）將目的基因與載體在體外連接形成重組DNA；（3）重組DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞；（4）篩選、鑒定陽性重組子；（5）重組子的擴(kuò)增。13 腫瘤基因治療基因工程所需的載體雖然內(nèi)切酶解決了異源DNA體外重組的技術(shù)問題，但是重組之后的異源DNA還必須回到細(xì)胞內(nèi)才能顯示出其生物活性。這就要求有一種運(yùn)送載體來充當(dāng)此角色。微生物中有一種非染色體一種環(huán)狀DNA或病毒可以做為載體，這樣載體的共同特點(diǎn)是：（1）它們都是環(huán)狀DNA；（2）都能專一性的感染某一細(xì)胞；（3）都具有某種選擇性標(biāo)記；（4）都具有一些內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)；（5）都可以隨染色體的復(fù)制而獨(dú)立復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增。14 腫瘤基因治療基因工程所需的工具酶 只有在DNA限制性內(nèi)切酶、載體質(zhì)粒、連接酶及其它修飾酶的作用下，才能實(shí)現(xiàn)隨心所欲地移動(dòng)和改造基因。內(nèi)切酶的共同特點(diǎn)是：它們都有專一性的DNA識(shí)別順序，都能在DNA鏈當(dāng)中切開DNA，故稱“內(nèi)切”的酶。但切開的方式有兩種：（1）切成粘性末端；（2）切成平末端?；蚬こ萄芯烤褪抢昧藘?nèi)切酶可以專一性地把DNA切割成特定的粘性末端的特點(diǎn)，根據(jù)研究工作的實(shí)際需要，把一些不同來源，具有粘性末端的DNA片段重新連接或組合起來，這就是DNA技術(shù)的來由。15 腫瘤基因治療基因工程所需的細(xì)胞 293細(xì)胞是傳染腺病毒ELA基因的人胚腎上皮細(xì)胞系，有致瘤性，是轉(zhuǎn)化細(xì)胞。細(xì)胞感染病毒后，首先是細(xì)胞形態(tài)的變化，由于病毒能增強(qiáng)細(xì)胞膜的滲透性，細(xì)胞外的離子鈉離子流入胞內(nèi)，細(xì)胞可從原來的形態(tài)變?yōu)閳A形，然后由于細(xì)胞支架的降解或破裂導(dǎo)致細(xì)胞從基質(zhì)上脫落，最后破裂。二、腫瘤基因治療的常用方法21 基因沉默療法RNA干擾是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，與靶基因同源的外源性或內(nèi)源性雙鏈誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后引起特異性基因沉默?，F(xiàn)已闡明RNAi發(fā)生機(jī)制的大致模型。1)啟動(dòng)階段：長dsRNA 或短發(fā)夾RNA進(jìn)入細(xì)胞后，在一種具有RNase活性的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶作用下，被切割為2123個(gè)核苷酸組成的片段，即siRNA。2)效應(yīng)階段：siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，識(shí)別mRNA，其中的反義鏈與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，正義鏈則被置換出來。繼而，RISC中的Dicer在靶mRNA與siRNA結(jié)合區(qū)域的中間將其切斷。3)級(jí)聯(lián)放大：在RNA依賴性RNA 聚合酶的作用下，以mRNA 為模板，siRNA為引物，擴(kuò)增產(chǎn)生足夠數(shù)量的dsRNA作為底物提供給Dicer酶，產(chǎn)生更多的siRNA，從而使效應(yīng)階段反復(fù)發(fā)生，一個(gè)完整的mRNA就被降解成2l-23 nt的小片段，導(dǎo)致相應(yīng)的基因表達(dá)沉默。22 自殺基因療法自殺基因療法也稱前藥轉(zhuǎn)換酶基因療法，是指將某些病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，此基因編碼的特異性酶能將對(duì)細(xì)胞無毒或毒性極低的藥物前體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝成細(xì)胞的毒性產(chǎn)物，以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。自殺基因治療系統(tǒng)的種類很多，主要包括單純皰疹病毒I型胸苷激酶丙氧鳥苷系統(tǒng)、帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激梅新華 腫瘤基因治療的研究進(jìn)展酶阿糖甲氧基嘌呤系統(tǒng)、胞嘧啶脫氨酶5一氟胞嘧啶系統(tǒng)和硝基還原酶系統(tǒng)等。目前研究較多的是HSV tkGCV 系統(tǒng)，研究者正在致力于提高自殺基因療法的效率。在自殺基因的探索中，不少究者發(fā)現(xiàn)，少量的自殺基因轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞按一定的比例混合后培養(yǎng)，不僅轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞被殺滅，兩者相互接觸后相鄰的未轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞也大量死亡，此即“旁觀者效應(yīng)”。治療中，“旁觀者效應(yīng)”是一重要特征，即有毒代謝物通過縫隙連接或凋亡小體從轉(zhuǎn)染細(xì)胞移動(dòng)到鄰近細(xì)胞，對(duì)其產(chǎn)生殺傷作用，大大提高了自殺基因的殺傷效應(yīng)。23 免疫基因療法免疫基因治療是通過基因重組技術(shù)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能，達(dá)到治療腫瘤的目的，主要包括增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞功能的細(xì)胞因子基因療法、調(diào)節(jié)增強(qiáng)抗原識(shí)別能力的主要組織相容性復(fù)合物的基因療法和共刺激分子基因療法等。在腫瘤免疫治療中，免疫活性細(xì)胞的免疫監(jiān)督和殺傷活性起著重要作用。細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞低反應(yīng)性的一個(gè)主要原因是腫瘤細(xì)胞表面共刺激分子B-7家族的低表達(dá)，導(dǎo)致CD28和CD152以及B-7之間相互作用減弱。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用需要識(shí)別細(xì)胞表面的T細(xì)胞抗原受體和主要組織相容性復(fù)合體分子。相反，F(xiàn)as-FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用無特異性。因?yàn)槟[瘤表面通常表達(dá)Fas，所以FasL和CTI 是抗腫瘤的兩大武器。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細(xì)胞通過抑制APC，特別是DC的抗原遞呈作用來逃避宿主對(duì)其進(jìn)行的免疫攻擊。DC來源的腫瘤疫苗將是具有巨大潛力的腫瘤免疫治療手段。24 基因替代療法抑癌基因亦稱抗癌基因，是指正常細(xì)胞內(nèi)存在的能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的一類基因群?；蛱娲委熅褪抢幂d體將缺失的抑癌基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，以達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。目前已分離克隆出20余種抑癌基因，p53基因是與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，腫瘤生成會(huì)伴隨p53的缺失。目前研究的抑癌基因還有Fhit及第10號(hào)染色體丟失的張力蛋白同源的磷酸酯酶等，但真正應(yīng)用到臨床，還需要大量的研究。sible sites，AAS)，并轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞株MNK-45，實(shí)驗(yàn)組Survivin RNA 和蛋白水平明顯下降，部分腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的特征性改變。并且這種作用與AAS的位置有關(guān)系，提示反義Survivin能夠誘導(dǎo)凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長。分化抑制因子又稱DNA結(jié)合抑制因子，屬于螺旋環(huán)一螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，與腫瘤的發(fā)生、侵襲及腫瘤血管生成等方面密切相關(guān)。Id蛋白可成為腫瘤靶向治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。目前用于反義治療的基因還有Bcl-2、cerb-B2和增殖細(xì)胞核抗原等。25 反義基因療法 反義基因療法就是根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，用人工合成或生物體表達(dá)的特定DNA或RNA片斷(反義核酸)，抑制或封閉專一靶基因的技術(shù)。Tong等在體外通過隨機(jī)寡核苷酸庫聯(lián)合特定軟件分析，選擇合適的Survivin反義位點(diǎn)在腫瘤生成與轉(zhuǎn)移中新生血管發(fā)揮重要作用，VEGF和轉(zhuǎn)化生長因子是促進(jìn)新生血管生成的主要生長因子，以VEGF作用最強(qiáng)。與其他基因治療相比，該療法無需直接轉(zhuǎn)染腫瘤靶基因，只需轉(zhuǎn)染腫瘤4周，創(chuàng)造抑制血管生成的環(huán)境。小鼠血管內(nèi)給予針對(duì)VEGF受體的siRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)，VEGF受體表達(dá)減少，腫瘤的生長速度和血管生成明顯減少。26 多藥耐藥相關(guān)的基因療法多藥耐藥(MDR)是指在化療藥物治療腫瘤中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞的非特異普遍耐藥性。導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞MDR 的一個(gè)重要原因是MDR1基因擴(kuò)增和過度表達(dá)。MDR相關(guān)的基因治療一般集中在抑制腫瘤細(xì)胞的MDR1基因表達(dá)，從而增加常規(guī)化療的效果。郭華等以MDR1基因mRNA為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成2個(gè)反義肽核酸(PNA)序列，利用PNA-DNA 雜交，陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐藥細(xì)胞株SK-N-SH。檢測(cè)顯示，SK-NSH 細(xì)胞P-gP表達(dá)明顯降低，MDR1mRNA表達(dá)輕度下降，細(xì)胞內(nèi)多柔比星(ADM)聚集濃度明顯增加，PNA在MDR1基因抑制中的特殊作用為逆轉(zhuǎn)腫瘤的MDR提供了新的途徑。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF 1)對(duì)于腫瘤MDR 形成有多方面的作用，以HIF-1為靶點(diǎn)的腫瘤治療，為克服腫瘤放、化療抵抗提供了新思路。27 抗腫瘤新生血管形成療法反義基因療法就是根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，用人工合成或生物體表達(dá)的特定DNA或RNA片斷(反義核酸)，抑制或封閉專一靶基因的技術(shù)。Survivin是一種凋亡抑制基因，它在正常組織中不表達(dá)，而在胚胎發(fā)育組織和多數(shù)人類腫瘤組織中均有程度不同的表達(dá)。28 抗端粒酶療法端粒是位于染色體末端的復(fù)合結(jié)構(gòu)，調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂，隨著細(xì)胞分裂將逐步縮短，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。故端粒的持續(xù)存在是腫瘤細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠以自身RNA為模板合成端粒的末端重復(fù)序列5-TTAG-3 ，以補(bǔ)償端粒片段的缺失，在正常組織中通常處于抑制狀態(tài)，但在惡性腫瘤和永生化的細(xì)胞中常處于激活狀態(tài)。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的活性限速成分。迄今已發(fā)現(xiàn)6種類型的核酶，其中錘頭狀核酶由于結(jié)構(gòu)簡單，設(shè)計(jì)方便，成為基因治療的首選。三、我國腫瘤基因治療的現(xiàn)狀 我國是較早開展基因治療研究和臨床試驗(yàn)的國家。早在1985年，吳曼院士就提出了腫瘤是基因治療的重要目標(biāo)。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，在基因?qū)牒突蛑委熝芯亢团R床試驗(yàn)等方面都取得了很大進(jìn)展，目前我國已有重組腺病毒-p53抗癌注射液,TK基因治療惡性腦膠質(zhì)瘤,以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤細(xì)胞治療與基因治療、IL-2基因工程胃癌細(xì)胞瘤苗、HSV-tk基因治療肝癌等幾個(gè)腫瘤基因治療方案進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，并建立了生物領(lǐng)域病毒載體研發(fā)基地，主要開展腺病毒相關(guān)病毒載體用于治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究。目前我國已經(jīng)有30余個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因治療方案，并在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。四、腫瘤基因治療的發(fā)展趨勢(shì)近年來，載體系統(tǒng)的不斷完善和發(fā)展，相關(guān)的基因治療研究和試驗(yàn)報(bào)道層出不窮，然而真正意義上的突破卻不容樂觀，主要有：（1）沒有十分理想的治療基因，不同個(gè)體發(fā)生腫瘤免疫逃逸的機(jī)理可能不同，目前還沒有一個(gè)公認(rèn)的與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因。（2）體內(nèi)基因傳染效率較低，限制了治療基因的表達(dá)。（3）對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。（4）導(dǎo)入的目的基因難以控制，腫瘤細(xì)胞的靶向性不強(qiáng)，損害正常細(xì)胞的功能。根據(jù)以上目前腫瘤基因治療的研究主要集中在：（1）尋找新的更有效的治療基因；（2）尋找更好的載體增加傳染效率；（3）選擇更合適的導(dǎo)入途徑。 總之，由于腫瘤是多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜的基因疾病，依靠單一方法并不能達(dá)到理想的抗腫瘤效果，因此多種治療聯(lián)合、針對(duì)腫瘤的不同特征進(jìn)行個(gè)體治療也已成為基因治療發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。參考文獻(xiàn)1 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