流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應(yīng)用PPT課件

流式細胞術(shù)FlowCytometry,（FCM）,什么是流式細胞儀,流式細胞儀實物,BDFACSVantage,BD-Calibur,1.發(fā)展歷史1934Moldavan1973Steinkamp,一、概述,2.定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒子進行分析和分選的技術(shù).3.特點測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個乃至上萬個細胞可進行多參數(shù)測量在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術(shù)。,凡是能被熒光素標記的細胞或顆粒都可用流式細胞儀檢測。前提這種熒光素能被流式細胞儀所配置的激光光源激發(fā)在生物檢測技術(shù)中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。,4.應(yīng)用范圍,二、流式細胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu),待測細胞以單個細胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。,液柱與激光束相交，細胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。,基本結(jié)構(gòu),流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。,三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù),非熒光信號,顆粒度,細胞大小,前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復(fù)雜性,血液涂片,外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖,熒光信號,熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標記的細胞與無熒光標記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細胞與低FL細胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。,熒光信號與細胞特性,熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。定量染色熒光信號大小被標記組分含量的定量多熒光標記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量,光信號分離，導(dǎo)向各探測通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。,光信號收集,三數(shù)據(jù)處理及流式報告,FSCSSCFL1FL2FL3,對數(shù)線性線性線性對數(shù),脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換,光信號,電信號,記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果,（面積，峰高，寬度）,流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點圖和直方圖。幾個概念：%Gated：陽性細胞百分比。反映細胞群體中陽性細胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達量有關(guān)，在正態(tài)分布時一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強度，在陽性細胞為偏態(tài)分布時一般用該值。,散點圖,密度圖,二維等高圖,直方圖,圖報告中常見的幾種流式細胞圖,圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死,流式細胞儀數(shù)據(jù)分析,點圖分析,流式細胞儀數(shù)據(jù)分析,直方圖分析,圖中100101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞,五、流式細胞術(shù)的應(yīng)用,細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞顆粒度細胞表面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量,細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)/外的細胞因子激素結(jié)合位點、細胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細胞膜電位、線粒體膜電位,一）細胞DNA含量檢測,細胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結(jié)合于細胞DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。,單參數(shù)直方圖,圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期細胞，兩者中間代表S期細胞。這是以2倍體和4倍體細胞為主的流式DNA圖,DNA細胞周期分析,細胞周期,G2,M,G0,G1,s,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,細胞數(shù)量,2倍體,異倍體,4倍體,腫瘤組織中的各種DNA倍體,含量與凋亡關(guān)系,DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。凋亡過程中，細胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標本制備中的固定處理時，細胞膜的完整性被破壞，使細胞內(nèi)降解的DNA片段從細胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。,二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究,1.腫瘤診斷,DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志細胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細胞學(xué)診斷。,2倍體,異倍體,4倍體,腫瘤組織中的各種DNA倍體,2.凋亡研究,在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。,AnnexinVAssay,圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死,Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48,圖FCM測試細胞周期分布和凋亡,根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測,在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變小；細胞膜皺折卷曲，但早期細胞膜的完整性未受到破壞凋亡細胞的FSC？SSC？細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？,CD3(T細胞，CD4、CD8)、CD19（B細胞）、CD16、CD56（NK細胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。,三）淋巴細胞分類,流式細胞術(shù)檢測細胞表型,流式細胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復(fù)性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。,四）白血病的免疫分型,五）細胞內(nèi)蛋白的分析：,細胞破膜后將細胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光標記，用流式細胞儀進行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。熒光探針多為FITC。,熒光信號,使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量,熒光樣本制備,雙色直接染色,端粒（熒光蛋白）,.,六）細胞內(nèi)鈣離子測定1106/ml的細胞懸液，加入終濃度為1-5mol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hanks平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。,FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒體功能,M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ)水平、未受刺激時等。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。,六.分選：,用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，大