PCR反應(yīng)中基本成分(引物、dNTP、模板等)的作用

PCR反應(yīng)中基本成分（引物、dNTP、模板等）的作用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)包括三個(gè)基本步驟，即：模板DNA的變性、模板DNA與引物的退火復(fù)性、引物的延伸。PCR反應(yīng)體系包括5種基本成分，依次為：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)包括三個(gè)基本步驟，即：模板DNA的變性、模板DNA與引物的退火復(fù)性、引物的延伸。PCR反應(yīng)體系包括5種基本成分，依次為：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。1、引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板 DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。2、酶目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。3、dNTPdNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。dNTP儲(chǔ)存液：dNTP溶于pH為7.0的NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到10mol/L，分裝后存放在-20冰箱中。dNTP使用濃度在20200 mol/L之間。4種dNTP必須等濃度配合以減少錯(cuò)配誤差。dNTP使用濃度：在PCR反應(yīng)中,使用低dNTP濃度,可減少非靶位置啟動(dòng)和延伸時(shí)的核苷酸錯(cuò)誤摻入。一般可根據(jù)靶序列的長(zhǎng)度和組成來(lái)決定最低dNTP濃度。例如在100l的反應(yīng)體系中,4種dNTP的濃度為20mol/L,可基本滿足合成2.6g DNA或10pmol/L的400bp序列。使用低dNTP濃度(每種dNTP濃度為2mol/L),能夠高度靈敏地(1/107)擴(kuò)增ras基因點(diǎn)突變的等位基因。4、模板模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。5、Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，不好的引物嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，好的引物可以事倍功半;酶的選擇