幾丁質(zhì)酶基因的克隆和在伯克氏菌中的表達(dá).doc

(中國生物防治，2006年, 22（增）：72-77)芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因的克隆、序列分析及其在伯克氏菌B418中的表達(dá)黃玉杰1 楊合同12作者簡介：黃玉杰（1977），女，碩士，助研。*通訊作者,電子信箱:基金項目：山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目（2004BS06007） 周紅姿1 李紀(jì)順1 吳遠(yuǎn)征1 扈進(jìn)冬11 山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，濟南 250014；2 山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淄博 255049摘要 采用PCR技術(shù)擴增到枯草芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因的編碼序列。片段共2227bp，含有一個具有1788個核苷酸的開放閱讀框架，起始密碼子位于211bp，終止密碼子位于1998bp，共編碼氨基酸605個。序列比較發(fā)現(xiàn)同已發(fā)表的Bacillus subtilis幾丁質(zhì)酶核苷酸具有99.39%的同源性。將該基因與大腸桿菌伯克氏菌穿梭質(zhì)粒pRK415連接，獲得重組質(zhì)粒pRChi113。重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入伯克氏菌B418中，獲得工程菌株B418-9、B418-13。與野生菌株相比，平板拮抗實驗表明，工程菌株對Verticillum dahliae、Rhizoctonia solani、Helminthosporium sativum、Rhizoctonia cerealis抑菌效果明顯提高。關(guān)鍵詞 幾丁質(zhì)酶 克隆 轉(zhuǎn)化 伯克氏菌幾丁質(zhì)酶（EC4）是催化降解幾丁質(zhì)的一類糖基水解酶，它可將由-1,4-N-乙酰-D-葡聚糖（NAG）殘基組成的幾丁質(zhì)降解為低分子量的NAG1。幾丁質(zhì)酶廣泛存在于有機物中，這些有機物本身可能不產(chǎn)生幾丁質(zhì)，例如細(xì)菌、真菌、昆蟲、高等植物（PR蛋白）和動物等，對防治病原真菌具有重要的作用。顧真榮2曾報道三種產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的芽孢桿菌（短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌）對病原菌的抑菌作用。本實驗室從小麥根際土壤中分離到了具有幾丁質(zhì)酶活性的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis Ap113。通過設(shè)計引物獲得幾丁質(zhì)酶編碼基因，并進(jìn)行序列分析，并將該基因利用電擊方法導(dǎo)入到具有固氮、解磷、解鉀，促進(jìn)植物生長作用伯克氏菌B418中，以提高該菌的生防效果，為生產(chǎn)高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶工程菌株奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株與質(zhì)粒 見表1表1 細(xì)菌菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmidsStrains/PlasmidsCharacteristicsSourceB.subtilis Ap113具有幾丁質(zhì)酶活性Store in this labBurkholderia B418具有解磷、解鉀、促進(jìn)植物生長作用Store in this labE.coli DH5EndA1,hsdR17，thi-1,relA1,gyrA,recA1,80LacZM15，（LacZYA-argF）U169Store in this labpMD18-TAmpr購自TakarapMChi113Ampr，攜帶幾丁質(zhì)酶基因本室連接重組獲得pMSDChi113Ampr，攜帶幾丁質(zhì)酶基因，并在幾丁質(zhì)酶基因前具有SD序列本室連接重組獲得pRK415Ampr，Tetr中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張力群惠贈pRChi113帶有幾丁質(zhì)酶基因片段本室連接重組獲得1.1.2 培養(yǎng)基B418固體培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4 0.5，MgSO47H2O 0.2，NaCl 0.02，CaCl2 0.2，NaMoO42H2O 0.002，乙二胺四乙酸鐵鈉鹽 0.066, 谷氨酸鈉 0.05,葡萄糖 5,瓊脂 15,pH 7.2-7.4B418液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 10,酵母浸出物 1, CaCl2 0.2，pH 7.2-7.4大腸桿菌培養(yǎng)基LB、SOC見參考文獻(xiàn)3幾丁質(zhì)培養(yǎng)基見參考文獻(xiàn)41.1.3 酶和試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA ligase等分別購自上海生工、TaKaRa Biotech公司，DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa Biotech公司，DNA片段回收試劑盒購自上海生工。X-gal、IPTG購自TaKaRa Biotech公司。1.2方法1.2.1 幾丁質(zhì)酶酶活性測定：見文獻(xiàn)51.2.2 染色體DNA的提取與純化：參照精編分子生物學(xué)實驗指南，并做一定的修改1.2.3 幾丁質(zhì)酶編碼基因引物的設(shè)計及PCR：根據(jù)GeneBank上有關(guān)芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶編碼基因的堿基順序，采用軟件Primer Premier設(shè)計引物，PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)程序參照精編分子生物學(xué)實驗指南3進(jìn)行，其中55復(fù)性60sec，共35個循環(huán)。擴增反應(yīng)完成后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。Chi113up:5-CCACATACGGTTTGAAGAGGCG-3Chi113do:5-CGACTCTGCGGAAATGTTGTGG-31.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析：將PCR產(chǎn)物純化，按照pMD18-T載體試劑盒的要求，將PCR產(chǎn)物與該載體連接，得到重組質(zhì)粒pMChi113按TSS致敏緩沖液法轉(zhuǎn)化E.coliDH5，經(jīng)酶切鑒定及酶活性檢測確認(rèn)后，序列測定。1.2.5穿梭載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化根據(jù)測序結(jié)果重新設(shè)計引物，在幾丁質(zhì)酶基因上游加上核糖體結(jié)合位點，chiSDup: 5AGGAGGTTGATATGAAA AAAGTGTTTTCA-3和chiEcoRIdo: 5-CGGAATTCTTATTTGCAATCACCAATT-3，PCR反應(yīng)為94預(yù)變性5min，其次94變性1min，39退火1.5min，72延伸2min，共10個循環(huán)，然后94變性1min，41退火1.5min，72延伸2min，共25個循環(huán)，最后72延伸20min。將得到的PCR產(chǎn)物同pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化，得到質(zhì)粒pMSDChi113。同時設(shè)計chiEcoRIup:5-CGGAATTCAGGAGGTTGATATGAAA AAAG和chiEcoRIdo進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件同上。利用EcoRI酶切PCR產(chǎn)物，同EcoRI酶切并去磷酸化的穿梭質(zhì)粒pRK415連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5，經(jīng)PCR和酶切檢測確認(rèn)后，獲得重組載體pRChi113，電擊轉(zhuǎn)入伯克氏菌B418中，得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴增檢測，并將長出的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至幾丁質(zhì)平板，28培養(yǎng)3-5d，挑取能產(chǎn)生水解圈的菌落，利用EcoRI和PstI進(jìn)行分別酶切檢測目的片段及其連接方向，確定重組伯克氏菌B418-9，B418-13。1.2.6 伯克氏菌B418與工程菌株B418-15的室內(nèi)拮抗效果比較各種病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)三天后，用滅菌打孔器取帶菌絲的圓盤型培養(yǎng)基塊，將培養(yǎng)基塊放在PDA平板的中央，B418、B418-9、B418-13分別點接在距中央2.5cm的周圍，同時以不加生防菌的平板做對照，28下培養(yǎng)96h后測量抑菌帶寬度。抑制率=1-(接細(xì)菌處病原菌擴展半徑對照病原菌擴展半徑)100。2 結(jié)果與分析2.1幾丁質(zhì)酶基因的克隆2.1.1 PCR及與T-載體的連接、轉(zhuǎn)化和篩選根據(jù)GenBank上有關(guān)芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因序列，設(shè)計引物，PCR擴增，產(chǎn)物的大小在1.8kb左右（圖1）。M 1 2 M 1 2 3 4圖1 幾丁質(zhì)酶基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of chitinase genes from B.subtilisM:Mark;Lane1,2,3:PCR產(chǎn)物;lane4:Ap113基因組DNA圖3 重組質(zhì)粒pRChi113的酶切檢測Fig.3 Identification of plasmid pRChi113 by enzyme digestionM:Mark;Lane1: pRChi113經(jīng)PstI酶切產(chǎn)生1kb的條帶;Lane2: pRChi113經(jīng)EcoRI酶切產(chǎn)生1.7kb的條帶1kb2kb10kb1882bp PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5，37培養(yǎng)過夜，藍(lán)白斑篩選到菌株23株，挑取一白斑，提質(zhì)粒并測序，該質(zhì)粒命名為pMChi113。2.1.2 幾丁質(zhì)酶基因的序列測定和序列分析含有重組質(zhì)粒pMChi113的轉(zhuǎn)化子送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果如下1 TGCTCCCGGCCGCCATGGTGGCCGCGGGAATTCGATTCCACATACGGTTTGAAGAGGCGTATGAAAACCAAAAATGTAAGC82 GTTTTCCCCTTGTTGTCTTCAGTGTCATCAGCTGCTATGTCAGGACAAGGTGAATATAAACCTATTGAAAAGGGGGTGAAC163 AAAATAGAGTTTCATTGATGAACAGCCAAAAAAATTGATGAAAAGGAGATGAAAAAAGTGTTTTCAAACAAAAAGTTTCTC M K K V F S N K K F L 244 GTTTTTTCTTTCATTTTTGCGATGATTTTAAGTCTGTCTTTTTTTAATGGGGAAAGTGCACAAGCCAGTTCTGACAAAAGT V F S F I F A M I L S L S F F N G E S A Q A S S D K S 325 TATAAAATCATCGGCTACTATCCGTCCTGGGGCGCTTATGGAAGGGATTTTCAAGTATGGGATATGGATGCTTCTAAAGTC Y K I I G Y Y P S W G A Y G R D F Q V W D M D A S K V 406 AGCCATATTAATTATGCATTTGCTGATATTTGCTGGGAGGGGAGGCATGGAAACCCTGATCCGACAGGCCCGAATCCCCAG S H I N Y A F A D I C W E G R H G N P D P T G P N P Q 487 ACATGGTCTTGCCAGGATGAAAACGGAGTGATTGATGTTCCAAATGGATCAATCGTTATGGGGGACCCATGGATCGATGTG T W S C Q D E N G V I D V P N G S I V M G D P W I D V 568 CAAAAGTCAAATGCCGGAGATACTTGGGATGAGCCGATTCGGGGCAACTTTAAACAACTATTGAAGCTGAAAAAGAACCAT Q K S N A G D T W D E P I R G N F K Q L L K L K K N H 649 CCTCATTTGAAAACATTCATATCAGTTGGCGGATGGTCTTGGTCAAATCGCTTTTCAGATGTTGCGGCAGATCCTGCGGCA P H L K T F I S V G G W S W S N R F S D V A A D P A A 730 AGAGAGAATTTTGCTGCTTCAGCAGTAAATTTTTTAAGAAAATATGGGTTTGATGGGGTCGACCTTGACTGGGAATACCCG R E N F A A S A V N F L R K Y G F D G V D L D W E Y P 811 GTTAGTGGAGGGCTGCCGGGAAACAGCACCCGTCCGGAGGATAAGAGAAACTACACGCTACTCTTGCAGGATGTGCGAGAA V S G G L P G N S T R P E D K R N Y T L L L Q D V R E 892 AAGCTTGACGCCGCAGAAGCGAAGGATGGCAAGAAATACTTGCTGACGATCGCCTCCGGCGCCAGTCCTGAATATGTAAGC K L D A A E A K D G K K Y L L T I A S G A S P E Y V S 973 AACACTGAATTAGATAAGATTGCTGAAACCGTTGATTGGATTAACATTATGACCTATGACTTTAATGGCGGATGGCAAAGT N T E L D K I A E T V D W I N I M T Y D F N G G W Q S 1054 ATAAGCGCTCATAATGCCCCATTATTCTATGATCCAAAAGCGAAAGAAGCCGGCGTTCCAAACGCTGAGACATTTAACATT I S A H N A P L F Y D P K A K E A G V P N A E T F N I 1135 GAAAGCACCGTGAAGCGCTACAAGGAAGCCGGTGTCAAAGCGGACAAATTAGTGCTTGGCACACCGTTCTATGGCAGAGGC E S T V K R Y K E A G V K A D K L V L G T P F Y G R G 1216 TGGAGCAATTGTGAGCCTGCAGACAACGGAGAATATCAAAAATGCGGACCGGCTAAAGAAGGGACGTGGGAAAAGGGGGTA W S N C E P A D N G E Y Q K C G P A K E G T W E K G V 1297 TTTGATTTTTCAGATCTTGAAAAGAACTACATCAATAAAAACGGATATAAAAGATATTGGAATGATCGAGCAAAAGTGCCG F D F S D L E K N Y I N K N G Y K R Y W N D R A K V P 1378 TTTTTGTATAATGCGGAGAATGGAAACTTCATTACCTACGATGATGAAGAATCATATGGATACAAAACCGATTTAATTCAA F L Y N A E N G N F I T Y D D E E S Y G Y K T D L I Q 1459 TCAAACGGATTAAGCGGGGCTATGTTTTGGGATTTCAGCGGTGATTCAAATCAGACTTTGCTCAACAAATTAGCAGCCGAT S N G L S G A M F W D F S G D S N Q T L L N K L A A D 1540 TTAGGGTTCGCTCCGGGTGAGGGTAATCCAGAGCCGCCTTCATCTGCACCGGGTAATTTGCGTGTGACCGAAAAAACCGCA L G F A P G E G N P E P P S S A P G N L R V T E K T A 1621 ACCAGTATCAGTCTGGCGTGGGATGCACCGAGCGACGGAGCAAACATCGCAGAGTATGTGCTGTCATATGAAGGCGGGGCC T S I S L A W D A P S D G A N I A E Y V L S Y E G G A 1702 GTATCGGTCAAGGATACATCGGCGACAATCGGGCAATTAAAGCCGAATACGACATACTCATTTACAGTATCTGCAAAGGAT V S V K D T S A T I G Q L K P N T T Y S F T V S A K D 1783 GCGGACGGAAAGCTCCATACCGGGCCAACGATAGAAGCAACAACAAACTCTGATCAAACATGTGGGTATAACGAATGGAAA A D G K L H T G P T I E A T T N S D Q T C G Y N E W K 1864 GATACAGCCGTCTACACAGGCGGAGACCGAGTCGTCTTTAACGGCAAAGTGTATGAAGCGAAATGGTGGACGAAAGGAGAG D T A V Y T G G D R V V F N G K V Y E A K W W T K G E 1945 CAGCCGGATCAGGCTGGTGAGTCGGGTGTATGGAAATTAATTGGTGATTGCAAATAAATCAGTTTGATAGAAAACGATAAA Q P D Q A G E S G V W K L I G D C K * 2026 GAGAGAGTGGGCTCCCCATCTCTCTTTATGAGAAAGGAGTATGAATGAAGTGAAAAGAACCGCTTTATTTACTTTGTCATC2107 GATGCTGCTCCTGTCACTTTTGACCCCGTTCCACAACATTTCCGCAGAGTCGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCA2188 GGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGAGACTA下劃線為引物Chi113up和Chi113do，方框內(nèi)分別是幾丁質(zhì)酶基因的啟動子和終止子。基因片段共2227bp，含有一個具有1788個核苷酸的開放閱讀框架，起始密碼子位于211bp，終止密碼子位于1998bp，共編碼氨基酸605個。在GenBank中進(jìn)行序列比較發(fā)現(xiàn)同已發(fā)表的Bacillus subtilis幾丁質(zhì)酶核苷酸具有99.39%的同源性。該片段編碼的氨基酸序列同已知的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列比較如圖2所示。由圖中可看到，該基因片段同已知的B.subtilis的chi和B.pumilus SG2 chiS氨基酸序列同源性比較高，分別為99%和96%，同B.cereus的幾丁質(zhì)酶和B.circulans的chiD同源性較底。圖2幾丁質(zhì)酶氨基酸序列比較Fig.2GeneTreeofchitinase2.2 重組質(zhì)粒pRChi113的構(gòu)建及向伯克氏菌B418的轉(zhuǎn)化以pMChi113為模板，chiSDup和chiEcoRIdo為引物進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化，獲得了重組質(zhì)粒pMSDChi113，以 pMSDChi113為模板，以chiEcoRIup和chiEcoRIdo為引物進(jìn)行擴增，將該PCR引物同質(zhì)粒pRK415連接，電激導(dǎo)入伯克氏菌B418中，以轉(zhuǎn)化后的菌落為模板，chiEcoRIup和chiEcoRIdo為引物進(jìn)行PCR擴增篩選，將篩選后的菌落同時轉(zhuǎn)移至幾丁質(zhì)平板和LB平板上培養(yǎng)，60h可以觀察到部分菌落在自身周圍產(chǎn)生透明圈，說明導(dǎo)入的幾丁質(zhì)酶基因得到了表達(dá)，但效果不明顯。挑取效果較好的兩株菌落培養(yǎng)后按照堿裂解方法提取質(zhì)粒，并用EcoRI和PstI酶切，電泳能檢測到1.8kb的目的片段條帶及經(jīng)PstI酶切的1kb的條帶（圖3），這兩株菌落分別命名為B418-9、B418-13。2.3 野生菌株B418與工程菌株B418-9、B418-13的室內(nèi)拮抗性比較野生菌株B418與工程菌株B418-9、B418-13對病原菌的抑制效果見圖4、圖5。結(jié)果表明，PDA平板上野生菌株B418與工程菌株B418-9、B418-13均有一定的抑制效果，且經(jīng)改造后的工程菌株抑菌能力明顯增強。圖4：野生菌B418與工程菌B418-9、B418-13對病原菌的抑制率Fig.4. Inhibition percentage of B418 and B418-9、B418-13 to pathogen1:Verticillum dahliae; 2:Rhizoctonia solani; 3:Helminthosporium sativum; 4:Rhizoctonia cerealis 3 討論本實驗中篩選到的伯克氏菌具有固氮、解磷、解鉀，促進(jìn)植物生長作用，并對病原菌具有一定的抑制作用。幾丁質(zhì)酶基因在植物抗病中具有重要的作用，該基因轉(zhuǎn)化的工程菌可以提高病害防治能力。至今未見用幾丁質(zhì)酶基因改造生防菌伯克氏菌方面的報道。田剛等6將環(huán)狀芽孢桿菌的幾丁酶基因chil整合到熒光假單胞桿菌染色體DNA上，但表達(dá)效率極低。2004年，徐小靜等將一幾丁質(zhì)酶基因片段轉(zhuǎn)入熒光假單胞桿菌中，平板拮抗實驗和盆栽防病試驗表明通過導(dǎo)入幾丁質(zhì)酶基因可以提高熒光假單胞桿菌的生防效果7。Jayaraman等2004年利用pDSK519在LacZ啟動子的控制下于Azospirillum brasilense中表達(dá)了水稻幾丁質(zhì)酶基因，但未將該基因整合到染色體上8。本研究中通過PCR方法獲得了枯草芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶基因chi113，并對其進(jìn)行改造，加入了SD序列，利用pRK415將該幾丁質(zhì)酶基因chi113導(dǎo)入到伯克氏菌B418中，一定程度上提高了B418的生防效果。但實驗中幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)效果不是很明顯，原因可能是伯克氏菌B418的表達(dá)系統(tǒng)不能有效識別幾丁質(zhì)酶基因上游啟動子序列，或者該啟動子不能有效啟動枯草芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)。同時，研究中的工程菌株在長期使用中，會出現(xiàn)質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。因此在下一步的研究中一方面引入適宜的啟動子以提高基因的大量表達(dá)，同時嘗試將該幾丁質(zhì)酶基因整合到伯克氏菌B418的染色體DNA上，以獲得更為廣譜高效多功能植物病害生物防治菌株。圖5: 野生菌B418與工程菌B418-9、B418-13對病原菌的室內(nèi)拮抗性比較Fig.5. Inhibition compare of B418 and B418-9、B418-13 to pathogen in vitroA：Rhizoctonia cerealis； B：Rhizoctonia solani；C：Verticillum dahliaeCKCKCKB418-13B418-13B418-13B418-9B418-9B418-9B418B418B418CBA參考文獻(xiàn)1 黃玉杰，楊合同，丁愛云，2002，幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶生物學(xué)特性及其編碼基因的克隆和轉(zhuǎn)化山東科學(xué)第15卷第1期28-342 顧真榮 馬承鑄 韓長安2001產(chǎn)幾丁質(zhì)酶芽孢桿菌對病原真菌的抑菌作用上海農(nóng)業(yè)學(xué)報17（4）88-923 顏子穎，王海林譯1998精編分子生物學(xué)實驗指南科學(xué)出版社出版4 Wang Y-M, Tang W-H. Expression of chitianase and -1,3-glucanase genes in Bacillus subtilis B-908. Liu Y. Res Control Plant Disease. Beijing: China Agri Sci and Tech Press,1998. 423-426(in Chinese)5 Alam, M.M., T.Mizutani, M.Isono, N.et al. 1996. Three chitinase genes (chiA, chic, and chiD) comprise the chitinase system of Bacillus circulans WL-12. 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