方 血紅蛋白的提取和分離.PPT精選文檔

1,血紅蛋白的結(jié)構(gòu)示意,2,3,根據(jù)課題背景回答下列問題：,4,2003年4月14日宣布人類基因組序列圖完成這標(biāo)志著進(jìn)入了_和時(shí)代。,人類基因組：,蛋白質(zhì)組：_主要是對(duì)_,后基因組,蛋白質(zhì)組,指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。,生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和,蛋白質(zhì)功能的研究,血紅蛋白質(zhì)的主要功能是：_。,負(fù)責(zé)血液中O2和CO2的運(yùn)輸,5,思考1分離生物大分子的基本思路是什么？,選用一定的的方法，分離具有不同的生物大分子。,思考2蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？,根據(jù)蛋白質(zhì)各種_，如_、和、3、溶解度、4、吸附的性質(zhì)和等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。,特性的差異,1、分子的形狀,大小,物理或化學(xué),物理或化學(xué)性質(zhì),2、所帶電荷的性質(zhì)和多少,5、對(duì)其他分子的親和力,6,思考3高溫滅菌和酒精消毒分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？,變性,思考4人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？,雞的紅細(xì)胞具有_，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；人的紅細(xì)胞無_，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，_含量豐富便于提取血紅蛋白。,變性,空間結(jié)構(gòu),細(xì)胞核,細(xì)胞核,血紅蛋白,7,一、基礎(chǔ)知識(shí)：,凝膠色譜法（也叫分配色譜法）：,2、凝膠：,一些微小多孔的球體-分子篩（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖）,根據(jù)被，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的_（分子篩）的作用，來進(jìn)行分離。,1、概念：,分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小,凝膠,8,3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)_的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程_，移動(dòng)速度_，而_的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在_移動(dòng)，路程_，移動(dòng)速度_，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。,4、具體過程,相對(duì)分子質(zhì)量較小,較長(zhǎng),較慢,相對(duì)分子質(zhì)量較大,凝膠外部,較短,較快,9,10,11,也稱：洗脫瓶,12,1、概念：由溶解于水中，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。,緩沖溶液：,2、緩沖作用：在一定范圍內(nèi)，能夠抵制對(duì)溶液的影響，維持PH基本不變。,外界的酸、堿或稍加稀釋,PH值,12種緩沖劑,調(diào)節(jié)緩沖劑的就可以制得使用的緩沖液。,使用比例,在不同PH范圍內(nèi),13,3、緩沖溶液的正確配制和PH的準(zhǔn)確測(cè)定的重要性,生物體進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的PH下進(jìn)行的，為了能夠在實(shí)驗(yàn)條件下的過程，就必須保持的基本一致。,思考：說出人體血液中緩沖對(duì)。,NaH2PO4/Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi),體外溶液的PH與體內(nèi)環(huán)境中,14,電泳：,1、概念：_,思考：在血紅蛋白提取和分離的整個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的緩沖液是什么？它的目的是什么？,使用的是_，目的是利用緩沖液模擬_，保證血紅蛋白的_。）,磷酸緩沖液,細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境,正常結(jié)構(gòu)和功能,只有血紅蛋白_才能保證的材料的科學(xué)研究；材料為_色便于_。,指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。,仍具有活性,觀察,紅,15,2、原理：許多重要的生物大分子，如_等都具有_在_下，這些基團(tuán)會(huì)帶上_。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其_移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子_以及分子本身的_、_的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的_，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,多肽、核酸,可解離的基團(tuán),正電或負(fù)電,所帶電荷相反的電極,帶電性質(zhì)的差異,大小,形狀的,遷移速度,一定的PH,16,17,電泳方法分類：,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳：是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對(duì)于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。,聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE),18,聚丙稀酰胺凝膠電泳：,測(cè)定_通常用：（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳,蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量,聚丙稀酰胺凝膠：,是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑（N,N-亞甲基雙丙烯酰胺）在引發(fā)劑(過硫酸銨）和催化劑（四甲基己二胺）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠,19,電泳方法分類：,SDS是一種蛋白質(zhì)變性劑十二烷基硫酸鈉,SDS的作用是什么呢？,20,為了消除_對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中加入_，它能使_。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是_。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量_蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的_，使電泳遷移率完全取決于_。,蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它_以及_等因素。,SDS,單條肽鏈的分子量,分子的大小,所帶靜電荷的多少,分子的大小,靜電荷,蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性,大大超過了,電荷差別,21,二實(shí)驗(yàn)操作,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：,1.樣品處理,血液,血漿,水分,固體物質(zhì),血漿蛋白,無機(jī)鹽磷脂葡萄糖等,血細(xì)胞,白細(xì)胞,血小板,紅細(xì)胞（最多）,血紅蛋白（）,兩個(gè)a肽鏈,兩個(gè)一肽鏈,樣品處理粗分離純化純度鑒定,共四條肽鏈,90,22,23,24,每個(gè)肽鏈環(huán)繞_，此基團(tuán)可攜帶_。血紅蛋白因含有_而呈紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來分離血紅蛋白。,一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán),一分子氧或一分子二氧化碳,血紅素,(1)紅細(xì)胞的洗滌,血液100mL,攪拌10min,重復(fù)洗滌3次，直至表明：,紅細(xì)胞已洗滌干凈,上清液沒有黃色,低速短時(shí)間離心2min,吸出血漿,5倍體積生理鹽水,25,洗滌目的：去除_洗滌方法：_離心（洗滌速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使_等一同沉淀達(dá)不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的_，將下層_的紅細(xì)胞液體倒入_再加入用_的_質(zhì)量分?jǐn)?shù)為_溶液洗滌。,雜質(zhì)蛋白,低速短時(shí)間,黃色血漿,暗紅色,燒杯,白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,五倍體積,生理鹽水,0.9的氯化鈉,洗滌次數(shù)過少：,無法除去血漿蛋白,26,(2)血紅蛋白的釋放,加_到_體積，再加40體積的_，置于_上充分?jǐn)嚢?0分鐘,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白.,原血液,甲苯,磁力攪拌器,蒸餾水,目的分析：蒸餾水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分?jǐn)嚢?0分鐘的目的是_。,使紅細(xì)胞大量吸水脹裂,溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜,加速紅細(xì)胞的破裂,為什么加入甲苯而不是其他的無機(jī)溶劑？,27,(3)分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:,脂溶性沉淀層,分離過程,紅細(xì)胞混合液,離心管,燒杯,有機(jī)溶劑甲苯,高速離心10min,濾紙過濾,血紅蛋白,28,第1層（最上層）：（）甲苯層,第2層（中上層）：（）的沉淀層，（）色薄層固體,第3層（中下層）：（）的水溶液層（）的液體,第4層（最下層）：其它雜質(zhì)（）的沉淀層,無色透明,脂溶性物質(zhì),白,血紅蛋白,紅色透明,暗紅色,29,用濕濾紙過濾，除去_，于中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體,即為。,脂溶性沉淀層,血紅蛋白,分液漏斗,30,取ml的血紅蛋白溶液裝入中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的中，pH為，透析12小時(shí)，目的是或用于更換樣品中的。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。,除去樣品中小分子量的雜質(zhì),透析袋,磷酸緩沖液,7.0,緩沖液,(4)透析,1,血紅蛋白的粗分離,31,32,2.凝膠色譜制作,1）凝膠色譜柱的制作,取長(zhǎng)40厘米（不超過1m），內(nèi)徑1.6厘米（不超過2cm）的玻璃管，兩端需用砂紙磨平,底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的（），在0.5ml的（）頭部切下（）長(zhǎng)的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。,凹穴,移液管,5cm,純化方法,33,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則，還會(huì)導(dǎo)致，蛋白質(zhì)分離不徹底。,c.剪小圓片覆蓋在上，用的尼龍紗將橡皮塞包好，插到玻璃管一端。d、色譜柱下端用移液頭部做，連接一細(xì)的，并用螺旋夾控制尼龍管的，另一端放入收集的收集器內(nèi),橡皮塞的凹面,100目,上部,出口部位,尼龍管,打開與關(guān)閉,色譜流出液,難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng),液體殘留,尼龍網(wǎng),34,安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。,頂塞的制作：,插入安裝了玻璃管的橡皮塞,組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。,安裝了玻璃管,35,2）凝膠色譜柱填料的處理,（1）凝膠的選擇：（）（G-75）：“G”表示凝膠的、及。75表示凝膠的，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水。,（2）方法：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于（也可用洗脫緩沖液）中充分溶脹后，配成。,蒸餾水,凝膠懸浮液,交聯(lián)葡聚糖凝膠,交聯(lián)程度,膨脹程度,分離范圍,得水值,7.5克,36,固定：將色譜柱處置固定在支架上,裝填：將（）一次性的緩慢倒入（）內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。,（3）凝膠色譜柱的裝填方法,凝膠懸浮液,色譜柱,注意：凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填凝膠柱時(shí)不能有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。,37,立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h,洗滌平衡,一次性緩慢倒入；輕輕敲打,裝填懸浮液,凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹,根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量,色譜柱垂直固定在支架上,配制懸浮液,計(jì)算稱量凝膠,固定色譜柱,材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-7520mmol/L磷酸緩沖液“G”表示什么？75代表什么？,2、凝膠色譜柱的裝填,38,洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在()高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分（）12小時(shí)。,洗滌平衡,注意液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否則重新填裝。,50cm,39,3）樣品加入與洗脫,加樣前,打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關(guān)閉出口,緩沖液,凝膠面,50cm,40,加透析樣品,41,調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用（）將1ml（）的樣品加到色譜柱的（）樣品滲入凝膠床：（）洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫收集：待（）接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每（）收集一試管連續(xù)收集,注意正確的加樣操作：不要觸及破壞凝膠面貼壁加樣使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng),吸管,透析液,頂端,樣品完全進(jìn)凝膠層,5ml,紅色的蛋白質(zhì),42,血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即（）；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的（）；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行（）。,思考,樣品的粗分離,純化,純度鑒定,你能描述血紅蛋白的提取和分離的完整過程嗎？P70第4題,43,血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。,思考,44,3.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,判斷（）的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的純度鑒定。,純化,血紅核蛋白純度鑒定,45,觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？,由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。,46,如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。,3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？,47,回憶蛋白質(zhì)的有關(guān)知識(shí),48,(一）蛋白質(zhì),占細(xì)胞干重的50以上，細(xì)胞中含量最多的有機(jī)物,2、組成元素,C、H、O、N,一、基礎(chǔ)知識(shí),1、含量,3、相對(duì)分子質(zhì)量,高分子化合物,49,4、基本組成單位,氨基酸,5、氨基酸通式,6、氨基酸連接方式,脫水縮合,50,8、分子結(jié)構(gòu),7、肽鍵,51,10、生理功能,細(xì)胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者,氨基酸的種類不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬別,9、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性,52,氨基酸間脫水縮合時(shí)，原來的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一個(gè)氨基，另一端只有一個(gè)羧基（不計(jì)R基上的氨基和羧基）。所以對(duì)于一條多肽鏈說，至少應(yīng)有的氨基和羧基都是一個(gè),若有個(gè)n氨基酸分子縮和成m條肽鏈,則可形成n-m個(gè)肽鍵,脫去個(gè)n-m個(gè)水分子，至有氨基和羧基各m個(gè),11、相關(guān)計(jì)算,53,（1）血紅蛋白提取和分離的程序可分為四步：_、_、_和_。（2）實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。加入檸檬酸鈉的目的_。以上所述的過程即是樣品處理，它包括_、_、收集血