GB 15193.5-2014 食品安全國家標準 哺乳動物紅細胞微核試驗

書書書犌犅前言本標準代替骨髓細胞微核試驗。本標準與相比，主要變化如下：標準名稱修改為“食品安全國家標準哺乳動物紅細胞微核試驗”；修改了范圍；增加了術語和定義；增加了試驗報告；增加了試驗的解釋；修改了試驗目的和原理；修改了實驗動物；修改了給予程序；修改了標本制作；修改了閱片的內(nèi)容。犌犅食品安全國家標準哺乳動物紅細胞微核試驗范圍本標準規(guī)定了哺乳動物紅細胞微核試驗的基本試驗方法和技術要求。本標準適用于評價受試物的遺傳毒性作用。術語和定義微核細胞有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進入子細胞形成細胞核時，仍留在細胞質中的整條染色單體或染色體的無著絲斷片或環(huán)。在末期單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在細胞的胞質內(nèi)而形成。著絲粒在細胞分裂期染色體與紡錘體纖維連接的區(qū)域，以使子染色體有序移動到子細胞兩極。正染紅細胞成熟的紅細胞，其缺乏核糖體并可用選擇性核糖體染料與未成熟的嗜多染紅細胞區(qū)分。嗜多染紅細胞未成熟的紅細胞處于發(fā)育的中間期，仍含有核糖體，故可用選擇性核糖體染料與成熟的正染紅細胞區(qū)分?？偧t細胞正染紅細胞和嗜多染紅細胞的總和。試驗目的和原理哺乳動物紅細胞微核試驗通過分析動物骨髓和（或）外周血紅細胞，用于檢測受試物引起的成熟紅細胞染色體損傷或有絲分裂裝置損傷，導致形成含有遲滯的染色體斷片或整條染色體的微核。這種情況的出現(xiàn)通常是受到染色體斷裂劑作用的結果。此外也可能在受到紡錘體毒物的作用時，主核未能形成代之以一組小核，此時小核比一般典型的微核稍大。儀器和試劑儀器解剖器械、生物顯微鏡、載玻片等。犌犅試劑注：全部試劑除注明外均為分析純，試驗用水為蒸餾水。小牛血清：小牛血清濾菌后放入恒溫水浴保溫進行滅活。通常儲存于冰箱里。亦可用大、小鼠血清代替。染液：稱取染料，加入甲醇研磨，待完全溶解后，再加入甘油。置恒溫箱保溫，期間振搖數(shù)次，取出過濾，兩周后可用。應用液：取一份染液與份磷酸鹽緩沖液混合而成?，F(xiàn)用現(xiàn)配。磷酸鹽緩沖液（）：磷酸二氫鉀（）磷酸氫二鈉（）加蒸餾水至甲醇。試驗方法受試物受試物的配制：應將受試物溶解或懸浮于合適的溶媒中，首選溶媒為水、不溶于水的受試物可使用植物油（如橄欖油、玉米油等），不溶于水或油的受試物亦可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液或糊狀物等。受試物應現(xiàn)用現(xiàn)配，有資料表明其溶液或混懸液儲存穩(wěn)定者除外。給予途徑：應采用灌胃法。陽性對照物也可采用腹腔注射的方法。灌胃體積一般不超過體重，如為水溶液時，最大灌胃體積可達體重；如為油性液體，灌胃體積應不超過體重；各組灌胃體積一致。實驗動物動物種、系選擇：在利用骨髓時，推薦使用小鼠或大鼠。利用外周血時，推薦用小鼠。如果已經(jīng)證實某品系動物脾臟不清除有微核的嗜多染紅細胞，或對引起染色體結構或數(shù)目畸變的化學物檢測有足夠的敏感性，則此種動物可以利用。通常用周齡周齡，體重的小鼠或體重的大鼠，在試驗開始時，動物體重差異應不超過每種性別平均體重的。每組用兩種性別的動物至少各只。動物準備：試驗前動物在試驗動物房應進行至少環(huán)境適應和檢疫觀察。動物飼養(yǎng)：實驗動物飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料應符合國家標準和有關規(guī)定（、）。每個受試物組動物按性別分籠飼養(yǎng)，每籠只。試驗期間實驗動物喂飼基礎飼料，自由飲水。劑量受試物應設三個劑量組，最高劑量組原則上為動物出現(xiàn)嚴重中毒表現(xiàn)和（或）個別動物出現(xiàn)死亡的劑量，一般可取，低劑量組應不表現(xiàn)出毒性，分別取和作為中、低劑量。急性毒性試驗給予受試物最大劑量（最大使用濃度和最大灌胃容量）動物無死亡而求不出時，高劑量組則按以下順序：）體重；）人的可能攝入量的倍；）一次最大灌胃劑量進行設計，再下設中、低劑量組。另設溶媒對照組。陽性對照物可用環(huán)磷酰犌犅胺體重經(jīng)口或腹腔注射（首選經(jīng)口）給予。試驗步驟和觀察指標受試物給予經(jīng)口灌胃。根據(jù)細胞周期和不同物質的作用特點，可先做預試，確定取材時間。常用給受試物法。即兩次給受試物間隔，第二次給受試物后采集骨髓樣品。試驗還可以有以下種采樣方式：）以受試物次給予動物。以適當?shù)拈g隔采集骨髓樣品至少次，開始不早于給予后，最后不晚于給予后。早于給予后的采樣，應說明理由。外周血采樣以適當?shù)拈g隔至少次，開始不早于給予后，最后不晚于給予后。如在一個采樣時間發(fā)現(xiàn)陽性結果，則不需要進一步采樣。）每天次給予，共次或多次（間隔）給予，可在末次給予后之間采集骨髓次，對外周血可在末次給予后之間采樣次。若選用外周血正染紅細胞的含微核細胞率作為試驗觀察終點，動物給予的時間應達周以上。標本制作骨髓樣品：處死后取胸骨或股骨，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片，或用小牛血清沖洗股骨骨髓腔制成細胞懸液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定。當日固定后保存。將固定好的涂片放入應用液中，染色。立即用的磷酸鹽緩沖液或蒸餾水沖洗、晾干。寫好標簽，陰涼干燥處保存。外周血樣品：從尾靜脈或其他適當?shù)难懿杉庵苎?，血細胞立即在存活狀態(tài)染色或制備涂片并染色。為排除與使用非染料相關的人工假象可利用特異性染料（如吖啶橙或加）。這種方法的好處是不會排除常用染料（如）的使用。閱片選擇細胞完整、分散均勻，著色適當?shù)膮^(qū)域，在油鏡下觀察。以有核細胞形態(tài)完好作為判斷制片優(yōu)劣的標準。本方法系觀察嗜多染紅細胞的微核。用染色法，嗜多染紅細胞呈灰藍色，成熟紅細胞呈粉紅色。典型的微核多為單個的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質一致，呈紫紅色或藍紫色，直徑通常為紅細胞的。對每個動物的骨髓至少觀察個紅細胞，對外周血至少觀察個紅細胞，計數(shù)嗜多染紅細胞在總紅細胞中比例，嗜多染紅細胞在總紅細胞中比例不應低于對照值的。每個動物至少觀察個嗜多染紅細胞以計數(shù)有微核嗜多染紅細胞頻率，即含微核細胞率，以千分率表示。如一個嗜多染紅細胞中有多個微核存在時，只按一個細胞計。數(shù)據(jù)處理和結果評價數(shù)據(jù)處理按動物性別分別統(tǒng)計各組含微核細胞率的均數(shù)和標準差，利用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法如泊松（）分布或檢驗，對受試樣品各劑量組與溶劑對照組的含微核細胞率進行比較。結果評價試驗組與對照組相比，試驗結果含微核細胞率有明顯的劑量反應關系并有統(tǒng)計學意義時，即可確犌犅認為有陽性結果。若統(tǒng)計學上差異有顯著性，但無劑量反應關系時，則應進行重復試驗。結果能重復可確定為陽性。試驗報告試驗名稱、試驗單位名稱和聯(lián)系方式、報告編號。試驗委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。試驗開始和結束日期、試驗項目負責人、試驗單位技術負責人、簽發(fā)日期。試驗摘要。受試物：名稱、批號、劑型、狀態(tài)（包括感官、性狀、包裝完整性、標識）、數(shù)量、前處理方法、陽性對照物的相關信息。實驗動物：物種、品系、級別、數(shù)量、周齡、體重、性別、來源（供應商名稱、實驗動物生產(chǎn)許可證號）、動物檢疫、適應情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對濕度、實驗動物設施使用許可證號），飼料來源（供應商名稱、實驗動物飼料生產(chǎn)許可證號）。試驗方法：試驗分組、每組動物數(shù)、劑量選擇依據(jù)、受試物給予途徑及期限、采樣時間點、標本制備方法、每只動物觀察的細胞數(shù)、統(tǒng)計方法和判定標準。試驗結果：記錄每只動物觀察的嗜多染紅細胞數(shù)和含有微核的細胞數(shù)，以列表方式報告不同性別每組動物的嗜多染紅細胞數(shù)、含微核細胞率和嗜多染紅細胞在總紅細胞中的比例、劑量反應關系、陰性對照的歷史資料和范圍，并寫明結果的統(tǒng)計方法。試驗結論：根據(jù)試驗結果，對受試物是否能引起哺乳動物嗜多染紅細胞含微核細胞率增加做出結論。試驗的解釋陽性