原子力顯微鏡在納米生物學(xué)研究中的應(yīng)用.doc

-專(zhuān)業(yè)文檔，值得下載!-專(zhuān)業(yè)文檔，值得珍藏！-原子力顯微鏡在納米生物學(xué)研究中的應(yīng)用蔣青青1張利娟2張鈺1郭彥1任煒1張曉暉1王鑫艷1(1中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,上海200031,2重慶市畜牧科學(xué)院,重慶402460)摘要原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)自從1986年發(fā)明以來(lái)，作為一種重要的單分子研究工具，在包括細(xì)胞粘附、蛋白折疊以及蛋白間的相互作用等生物學(xué)過(guò)程的研究中得到了廣泛應(yīng)用。本文主要介紹原子力顯微鏡的原理，著重于研究相互作用時(shí)能壘大小的確定，以及常用的單分子表面修飾方法。關(guān)鍵詞原子力顯微鏡(AFM)；單分子；能壘；表面修飾1引言蛋白之間正常的相互作用是機(jī)體發(fā)揮其生理學(xué)功能的基礎(chǔ)。目前的生化方法可以檢測(cè)出蛋白間相互作用的親和力或速度常數(shù)。盡管這些方法可以估測(cè)出蛋白相互作用的速率和自由能的指標(biāo)，但是它們不能檢測(cè)相互作用動(dòng)力學(xué)的重要特征，而那些恰恰可以揭示各種不同的中間態(tài)或替代反應(yīng)途徑。近幾十年，很多可以直接用于測(cè)量生物分子間相互作用這一動(dòng)態(tài)過(guò)程的高分辨率的技術(shù)迅速發(fā)展，包括原子力顯微鏡、光鑷和生物膜力學(xué)探針等單分子技術(shù)。其中，原子力顯微鏡擁有低至納米和微秒水平的超高分辨率，為實(shí)時(shí)測(cè)量單分子間的相互作用提供了新的途徑1,2。采用單分子技術(shù)避免了其他方法的內(nèi)在缺陷，使實(shí)時(shí)檢測(cè)單個(gè)分子間的相互作用成為可能1,3,4。因此單分子技術(shù)無(wú)疑成了理解控制蛋白間結(jié)合、解離和過(guò)渡態(tài)能級(jí)圖的有力工具2,5。此外，在細(xì)胞表面，外力作用可以不斷的拉伸分子。比如細(xì)胞遷移時(shí)，利用單分子技術(shù)，可以觀察在牽引力誘導(dǎo)下細(xì)胞表面粘附受體受到粘附和去粘附的循環(huán)過(guò)程6。而傳統(tǒng)的生物技術(shù)要揭示蛋白間相互作用的內(nèi)力和外力的影響往往難以實(shí)現(xiàn)7。但是，采用原子力顯微鏡之類(lèi)的單分子工具，則可以直接測(cè)出保持蛋白復(fù)合體的力，并可測(cè)量反應(yīng)過(guò)程中的壓力和拉力2，有助于深入研究細(xì)胞表面收稿日期:2010-01-05接受日期:2010-8-31中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目百人計(jì)劃(No.0813S11411)資助項(xiàng)目通訊作者。TelFaxE-mail:-專(zhuān)業(yè)文檔，值得下載!-專(zhuān)業(yè)文檔，值得珍藏！-及蛋白間相互作用的動(dòng)力學(xué)能級(jí)和確定能壘。本文就原子力顯微鏡的原理、方法及其作為單分子工具在蛋白間相互作用研究中的應(yīng)用做一簡(jiǎn)要綜述，著重闡述研究相互作用時(shí)能壘大小的確定，以及常用的單分子表面修飾方法。2原子力顯微鏡簡(jiǎn)介2.1原子力顯微鏡工作原理原子力顯微鏡主要包括微懸臂、探針、樣品臺(tái)、能精確移動(dòng)樣品臺(tái)或微懸臂的壓電陶瓷轉(zhuǎn)換器、以及用于記錄微懸臂反射光偏移變化的包含了激光和光電探測(cè)器的光學(xué)偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)(圖1)。微懸臂的尖部置于倒置顯微鏡上，實(shí)時(shí)采集光學(xué)和原子力顯微鏡信號(hào)，從而能夠?qū)崟r(shí)觀察到細(xì)胞形態(tài)，更適宜對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行研究。原子力顯微鏡最早被用作成像工具4，通過(guò)有彈性的微懸臂掃描來(lái)探測(cè)樣品的形貌。在成像模式下，原子力顯微鏡是通過(guò)在X和Y軸方向，掃描連在其懸臂末端的探針在接觸樣品時(shí)實(shí)現(xiàn)的。在做樣品表面掃描時(shí)，壓電陶瓷不斷的校正微懸臂的位置從而保持偏離常數(shù)不變，通過(guò)探測(cè)探針的位置變化，可以轉(zhuǎn)化得到原子級(jí)分辨率的樣品表面形貌圖。為了把偏離轉(zhuǎn)換為力單位，微懸臂必須經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)測(cè)量，然后算出微懸臂的彈性系數(shù)kC。校準(zhǔn)微懸臂的方法有2種8：應(yīng)用已知的力常數(shù)F測(cè)出微懸臂的偏離x9，或者測(cè)量微懸臂的熱共振頻率10。目前最常用的方法是根據(jù)Hutter和Bechhoefer的方法10，把微懸臂看做一個(gè)簡(jiǎn)易的諧振器，振動(dòng)模式下每接收到一個(gè)自由度的熱能kBT/2，微懸臂即可從已測(cè)量過(guò)的微懸臂偏離方差來(lái)計(jì)算其彈性系數(shù)，即1/2kBT=1/2kC，其中kB和T分別代表波爾茲曼常數(shù)和絕對(duì)溫度。-專(zhuān)業(yè)文檔，值得下載!-專(zhuān)業(yè)文檔，值得珍藏！-Fig.1Schematicoftheatomicforcemicroscope(AFM)一束激光直接打在微懸臂上，繼而反射到裂像光電二極管上面，通過(guò)不同的A-B信號(hào)就反映出施加給探針的力。微懸臂小位移時(shí)遵從胡克定律，所以微懸臂彈性系數(shù)校正后的光電二極管信號(hào)即反映了探針和樣品間的相互作用力。2.2典型的原子力顯微鏡力曲線采用力掃描模式，原子力顯微鏡可以在單分子水平測(cè)定兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立表面間的相互作用，出現(xiàn)就是典型的原子力顯微鏡力曲線。當(dāng)微懸臂上抬時(shí)，通過(guò)測(cè)量相對(duì)于“零點(diǎn)力”的偏移量，得到懸臂接觸表面后返回的曲線，從而得到單個(gè)蛋白復(fù)合體間分開(kāi)的力(圖2)。在很多實(shí)驗(yàn)中，微懸臂的移動(dòng)速度達(dá)到每秒幾個(gè)微米時(shí)，力的曲線通過(guò)測(cè)定微懸臂速度就可得到。由于介質(zhì)中存在阻力，微懸臂在自由接近和向后拉時(shí)將經(jīng)受一個(gè)與速率成比例的彎曲常數(shù)。阻力不僅取決于微懸臂的速率和隨溫度變化的介質(zhì)的粘性，還取決于微懸臂的自身特點(diǎn)、樣品的形貌、以及微懸臂與樣品的接觸和分開(kāi)過(guò)程11。采用原子力顯微鏡的力掃描模式，Lee12和Florin13直接測(cè)出了單個(gè)親和素和生物素解開(kāi)的力。盡管這種方法1994年才第一次報(bào)道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種蛋白間相互作用的研究采用了這種或者類(lèi)似的方法。在研究抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin)與生物素(biotin)的相互作用時(shí)，所檢測(cè)出的是典型的力曲線：測(cè)量開(kāi)始后，壓力首先增大，然后移動(dòng)瓊脂糖小球逐漸接近微懸臂。小球和微懸臂接觸前，偏離/力信號(hào)保持在穩(wěn)定基線對(duì)應(yīng)的零點(diǎn)力處。小球與微懸臂接觸后，微懸臂就向上彎曲，導(dǎo)致偏離/力信號(hào)發(fā)生正向變化。當(dāng)達(dá)到了預(yù)設(shè)的力時(shí)(本例中是200pN)，壓力就停止增加?？股锼氐鞍祖溇睾蜕锼卦陬A(yù)設(shè)的接觸時(shí)間內(nèi)彼此接觸。當(dāng)壓力開(kāi)始回縮，并逐漸移動(dòng)小球回到它最初的位置時(shí)，微懸臂向下偏轉(zhuǎn)，從而揭示了這段時(shí)間內(nèi)的粘附接觸過(guò)程。小球繼續(xù)回縮，作用于抗生物素蛋白鏈菌素和生物素的電壓逐漸增加，直到最后鏈斷裂，通過(guò)在回縮軌跡上陡的垂直躍遷即可看出。最后，微懸臂退回到最初零力的靜止位置。-專(zhuān)業(yè)文檔，值得下載!-專(zhuān)業(yè)文檔，值得珍藏！-Fig.2ArepresentativeunbindingtraceArepresentativeatomicforcemicroscope(AFM)forcescan(i.e.,opticalsignalvs.piezodisplacement)underforcescanmode.ThetwointeractingsurfacesaretheAFMtipfunctionalizedwithstreptavidinandanagarosebeadwithimmobilizedbiotin.2.3探針與基底的表面修飾在研究蛋白-蛋白相互作用的時(shí)候，蛋白或者配體被固定在原子力顯微鏡微懸臂的探針上，相互作用的受體被連接在一個(gè)合適的表面。當(dāng)兩個(gè)表面相互接觸，探針離開(kāi)表面時(shí)分子的相互作用力被懸臂的形變反映出來(lái)。因此合適的探針和樣品處理對(duì)于這類(lèi)研究的成功是非常重要的。修飾探針的方法通常包括物理吸附和使用帶有特殊基團(tuán)交聯(lián)分子的共價(jià)連接，修飾基底與修飾探針的方法相似物理吸附或共價(jià)連接，云母、聚苯乙烯、玻璃以及鍍金的