GB 15193.23-2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 體外哺乳細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

書(shū)書(shū)書(shū)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)犌犅食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)（報(bào)批稿）發(fā)布實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布書(shū)書(shū)書(shū)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)的基本試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于評(píng)價(jià)受試物的體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變。術(shù)語(yǔ)和定義染色體結(jié)構(gòu)畸變通過(guò)顯微鏡可以直接觀察到的發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂中期的染色體結(jié)構(gòu)變化。如染色體中間缺失和斷片、染色體互換等。染色體結(jié)構(gòu)畸變可分為染色體型畸變（）和染色單體型畸變（）。染色體型畸變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個(gè)染色單體的相同位點(diǎn)均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組等改變。染色單體型畸變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組等改變。有絲分裂指數(shù)中期相細(xì)胞數(shù)與所觀察的細(xì)胞總數(shù)之比值；是反映細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。核內(nèi)復(fù)制在復(fù)制的期之后，細(xì)胞核未進(jìn)行有絲分裂就開(kāi)始了另一個(gè)期的過(guò)程。其結(jié)果是染色體有、倍的染色單體。裂隙染色體或染色單體損傷的長(zhǎng)度小于一個(gè)染色單體的寬度，為染色單體的最小錯(cuò)誤排列。試驗(yàn)?zāi)康暮驮硗ㄟ^(guò)檢測(cè)受試物是否誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞染色體畸變，評(píng)價(jià)受試物致突變的可能性。在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞暴露于受試物中。用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，使細(xì)胞停止在中期分裂相，隨后收獲細(xì)胞、制片、染色、分析染色體畸變。儀器和試劑儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈臺(tái)，離心機(jī)。犌犅培養(yǎng)液常用培養(yǎng)液（，），也可選用其他合適培養(yǎng)液。加入抗菌素（青霉素按、鏈霉素），將滅活的胎牛血清或小牛血清按的比例加入培養(yǎng)液。代謝活化系統(tǒng)犛輔助因子的配制鎂鉀溶液氯化鎂和氯化鉀加蒸餾水溶解至。犿狅犾犔磷酸鹽緩沖液（狆犎）磷酸氫二鈉（，），磷酸二氫鈉（，），調(diào)至，滅菌或?yàn)V菌。輔酶（氧化型）溶液無(wú)菌條件下稱取輔酶，用無(wú)菌蒸餾水溶解配制成溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。葡萄糖磷酸鈉鹽溶液稱取葡萄糖磷酸鈉鹽，用蒸餾水溶解配制成，過(guò)濾滅菌?，F(xiàn)用現(xiàn)配。大鼠肝犛組分的誘導(dǎo)和配制選健康雄性成年或大鼠，體重，約周齡周齡。將多氯聯(lián)苯（）溶于玉米油中，濃度為，按體重?zé)o菌操作一次腹腔注射，后處死動(dòng)物，處死前禁食。也可采用苯巴比妥鈉和萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制備，經(jīng)口灌胃給予大鼠苯巴比妥鈉和萘黃酮，劑量均為體重，連續(xù)，禁食后斷頭處死動(dòng)物。其他操作同多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)。處死動(dòng)物后取出肝臟，稱重后用新鮮冰冷的氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟數(shù)次，以便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。每克肝（濕重）加氯化鉀溶液，連同燒杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝臟，在玻璃勻漿器（低于，）或組織勻漿器（低于，）中制成肝勻漿。以上操作需注意無(wú)菌和局部冷環(huán)境。將制成的肝勻漿在低溫（）高速離心機(jī)上以犵離心，吸出上清液為組分，分裝于無(wú)菌冷凍管中，每管左右，最好用液氮或干冰速凍后置低溫保存。組分制成后，經(jīng)無(wú)菌檢查，測(cè)定蛋白含量（法），每毫升蛋白含量不超過(guò)為宜，并經(jīng)間接致突變劑鑒定其生物活性合格后貯存于低溫或冰凍干燥，保存期不超過(guò)年。犛混合液的制備一般由組分和輔助因子按組成的混合液，無(wú)菌現(xiàn)用現(xiàn)配?；旌弦号渲迫缦拢喝∩鲜隽姿猁}緩沖液、鎂鉀溶液、葡萄糖磷酸鈉鹽溶液、輔酶溶液、肝組分，混勻，置冰浴中待用?；旌弦簼舛纫话銥?，實(shí)際使用濃度可由各實(shí)驗(yàn)室自行決定，但需對(duì)其活性進(jìn)行鑒定，犌犅必須能明顯活化陽(yáng)性對(duì)照物，且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。秋水仙素溶液用溶液配制適當(dāng)濃度的儲(chǔ)備液，過(guò)濾除菌，在避光冷藏的條件下至少能保存?zhèn)€月。犿狅犾犔氯化鉀溶液氯化鉀加蒸餾水至。固定液甲醇冰醋酸為，臨用前配制。根據(jù)試驗(yàn)條件，可適當(dāng)調(diào)整冰醋酸的濃度，改善染色體分散度，但不宜過(guò)大，導(dǎo)致細(xì)胞破裂。姬姆薩（犌犻犲犿狊犪）染液取姬姆薩染料，置乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至，待完全溶解后，再加甘油，放入溫箱中保溫。保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過(guò)濾，周后使用，作為姬姆薩染液原液。使用時(shí)，取份姬姆薩染液原液，與份磷酸鹽緩沖液（）混合，配成其應(yīng)用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。磷酸鹽緩沖液（，）配制方法如下：）第一液：取磷酸氫二鈉（）溶于去離子水中，配成溶液；）第二液：取磷酸二氫鉀（）溶于去離子水中，配成溶液；）取第一液加于第二液中混勻，即為的磷酸鹽緩沖液。試驗(yàn)方法受試物固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于適合的溶媒中，并稀釋至適當(dāng)濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當(dāng)濃度。受試物應(yīng)無(wú)菌現(xiàn)用現(xiàn)配，否則須確認(rèn)儲(chǔ)存不影響其穩(wěn)定性。細(xì)胞株可選用中國(guó)倉(cāng)鼠肺（）細(xì)胞株或卵巢（）細(xì)胞株、人或其他哺乳動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞（）。試驗(yàn)前檢查細(xì)胞的核型和染色體數(shù)目，檢測(cè)細(xì)胞有無(wú)支原體污染。推薦使用中國(guó)倉(cāng)鼠肺（）細(xì)胞株。劑量劑量設(shè)置受試物至少應(yīng)取個(gè)檢測(cè)劑量。對(duì)有細(xì)胞毒性的受試物，其劑量范圍應(yīng)包括從最大毒性至幾乎無(wú)毒性（細(xì)胞存活率在的范圍內(nèi)）；通常濃度間隔系數(shù)不大于槡。最高劑量的選擇當(dāng)收獲細(xì)胞時(shí)，最高劑量應(yīng)能明顯減少細(xì)胞計(jì)數(shù)或有絲分裂指數(shù)（大于，如毒性過(guò)大，應(yīng)適當(dāng)增加接種細(xì)胞數(shù)）；同時(shí)應(yīng)該考慮受試物對(duì)溶解度、和摩爾滲透壓濃度的影響；對(duì)無(wú)細(xì)胞毒性或細(xì)胞毒性很小的化合物，最高劑量應(yīng)達(dá)到、或。犌犅對(duì)溶解度較低的物質(zhì)，當(dāng)達(dá)到最大溶解濃度時(shí)仍無(wú)毒性，則最高劑量應(yīng)是在最終培養(yǎng)液中溶解度限值以上的一個(gè)濃度。在某些情況下，應(yīng)使用一個(gè)以上可見(jiàn)沉淀的濃度，溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。細(xì)胞毒性的確定測(cè)定細(xì)胞毒性可使用指示細(xì)胞完整性和生長(zhǎng)情況的指標(biāo)，如相對(duì)集落形成率或相對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)率等。應(yīng)在系統(tǒng)存在或不存在的條件下測(cè)定細(xì)胞毒性。陽(yáng)性對(duì)照可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適宜的陽(yáng)性對(duì)照物，應(yīng)是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復(fù)的陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)不存在外源性代謝活化系統(tǒng)時(shí)，可使用的陽(yáng)性對(duì)照物有甲磺酸甲酯（，）、甲磺酸乙酯（，）、絲裂霉素（）、乙基亞硝基脲（，）、硝基喹啉犖氧化物（犖）等。當(dāng)存在外源性活化系統(tǒng)時(shí)，可使的陽(yáng)性對(duì)照物有苯并犪芘（犪），、環(huán)磷酰胺（）等。不加的陽(yáng)性對(duì)照常用絲裂霉素，其常用濃度為。其為的水溶液在下避光保存能存放周。加的陽(yáng)性對(duì)照常用環(huán)磷酰胺，其常用濃度為。其水溶液不穩(wěn)定，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。陰性對(duì)照溶媒應(yīng)為非致突變物，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細(xì)胞存活和活性。首選溶媒對(duì)照是不含血清的培養(yǎng)液和水，亦可使用二甲基亞砜（），但濃度不應(yīng)大于?？瞻讓?duì)照如果沒(méi)有文獻(xiàn)資料或歷史資料證實(shí)所用溶媒無(wú)致突變作用時(shí)應(yīng)設(shè)空白對(duì)照。試驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)與染毒試驗(yàn)需在加入和不加入（的終濃度常為，以細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)）的條件下進(jìn)行。試驗(yàn)前一天，將一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿（瓶）中以收獲細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)皿（瓶）的細(xì)胞未長(zhǎng)滿為標(biāo)準(zhǔn)，一般以長(zhǎng)到左右為佳；如用細(xì)胞，可接種個(gè)，放培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。試驗(yàn)時(shí)吸去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試物、混合液（不加混合液時(shí)，需用培養(yǎng)液補(bǔ)足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中處理。處理結(jié)束后，吸去含受試物的培養(yǎng)液，用溶液洗細(xì)胞次，加入含胎牛血清的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，于收獲細(xì)胞。于收獲前，加入細(xì)胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，終濃度為）。當(dāng)受試物為單一化學(xué)物質(zhì)時(shí)，如果在上述加入和不加入混合液的條件下均獲得陰性結(jié)果，則需加做長(zhǎng)時(shí)間處理的試驗(yàn)，即在沒(méi)有混合液的條件下，使受試物與試驗(yàn)系統(tǒng)的接觸時(shí)間延長(zhǎng)至。當(dāng)難以得出明確結(jié)論時(shí)，應(yīng)更換試驗(yàn)條件，如改變代謝活化條件、受試物與試驗(yàn)系統(tǒng)接觸時(shí)間等重復(fù)試驗(yàn)。收獲細(xì)胞與制片消化用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，待細(xì)胞脫落后，加入含胎?；蛐∨Ｑ宓呐囵B(yǎng)液終止胰蛋犌犅白酶的作用，混勻，放入離心管以的速度離心，棄去上清液。低滲加入氯化鉀溶液，用滴管將細(xì)胞輕輕地混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中低滲處理。固定加入固定液，混勻后固定以上，以速度離心，棄去上清液。重復(fù)一次，棄去上清液。滴片加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。玻片使用前用冰水浸泡。染色姬姆薩染液，。閱片在油鏡下閱片，每一劑量組應(yīng)分析不少于個(gè)分散良好的中期分裂相，且每個(gè)觀察細(xì)胞的染色體數(shù)在狀范圍之內(nèi)。對(duì)于畸變細(xì)胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標(biāo)位置及畸變類型。觀察指標(biāo)染色體數(shù)目的改變非整倍體：亞二倍體或超二倍體。多倍體：染色體成倍增加。核內(nèi)復(fù)制：核膜內(nèi)的特殊形式的多倍化現(xiàn)象。染色體結(jié)構(gòu)的改變斷裂：損傷長(zhǎng)度大于染色體的寬度。微小體：較斷片小而呈圓形。有著絲點(diǎn)環(huán)：帶有著絲點(diǎn)部分，兩端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并伴有一雙無(wú)著絲點(diǎn)斷片。無(wú)著絲點(diǎn)環(huán)：成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。單體互換：形成三輻體、四輻體或多種形狀的圖像。雙微小體：成對(duì)的染色質(zhì)小體。裂隙：損傷的長(zhǎng)度小于染色單體的寬度。非特定性型變化：如粉碎化、著絲點(diǎn)細(xì)長(zhǎng)化、黏著等。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)按不同劑量列表，指標(biāo)包括觀察細(xì)胞數(shù)、畸變細(xì)胞數(shù)、染色體畸變率、各劑量組及對(duì)照組不同類型染色體畸變數(shù)與畸變率等。裂隙應(yīng)單獨(dú)記錄和報(bào)告，但一般不計(jì)入總的畸變率。各組的染色體畸變率用檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。犌犅結(jié)果評(píng)價(jià)下列兩種情況可判定受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中為陽(yáng)性結(jié)果：）受試物引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并與劑量相關(guān)；）受試物在任何一個(gè)劑量條件下，引起的染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有可重復(fù)性。試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系方式、報(bào)告編號(hào)。試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期。試驗(yàn)摘要。受試物：名稱、鑒定資料、號(hào)（如已知）、純度、與本試驗(yàn)有關(guān)的受試物的物理和化學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性等。溶媒：溶媒的選擇依據(jù)為受試物在溶媒中的溶劑性和穩(wěn)定性。細(xì)胞株：細(xì)胞株的來(lái)源、名稱。試驗(yàn)條件：劑量、代謝活化系統(tǒng)、標(biāo)準(zhǔn)誘變劑、操作步驟等。代謝活化系統(tǒng)：制備所用酶的誘導(dǎo)劑、選用的動(dòng)物品種和來(lái)源、混合液的配方。對(duì)照物：陽(yáng)性對(duì)照物的名稱、生產(chǎn)廠家、批號(hào)和選用濃度。培養(yǎng)液：所用培養(yǎng)液的名稱、血清類別和使用濃度。接種的細(xì)胞密度以及所用培養(yǎng)皿（瓶）的規(guī)格。中期分裂阻斷劑：名稱、所用濃度、作用時(shí)間。處理時(shí)間：受試物與試驗(yàn)系統(tǒng)的接觸時(shí)間。制片方法、分析的中期分裂相數(shù)目、結(jié)果評(píng)價(jià)方法。試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)包括細(xì)胞毒性的測(cè)定、加受試物后的溶解情況及對(duì)和滲透壓的影響（如果有影響）。各劑量組和對(duì)照組細(xì)胞染色體畸變率。本實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組（常用溶媒，如）在本實(shí)驗(yàn)室歷史上的染色體畸變率范圍和檢