轉(zhuǎn)錄與基因表達調(diào)控.ppt

1、第十五章 RNA的生物合成,RNA生物合成： 1.轉(zhuǎn)錄 2.RNA復(fù)制,RNA RNA RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，或依賴于的聚合酶,第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄的基本特征,轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板、NTP為原料，按堿基配對原則，在RNA聚合酶的催化下合成與DNA互補的RNA鏈的過程。,一、轉(zhuǎn)錄的模板,模板鏈：DNA雙鏈中能指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的DNA單鏈，又稱反義鏈（負鏈）。 編碼鏈：與模板鏈堿基配對、在DNA雙鏈中不能指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的DNA單鏈，又稱為有義鏈（正鏈）。,5 3,3 5,模板鏈,編碼鏈,編碼鏈,模板鏈,轉(zhuǎn)錄方向,轉(zhuǎn)錄方向,DNA,轉(zhuǎn)錄模板,轉(zhuǎn)錄單位：RNA的生物合成始于DNA模板的一個特定位點，并在另一個位點處終止

2、，這一特定區(qū)域稱為轉(zhuǎn)錄單位，又稱為“結(jié)構(gòu)基因”。 啟動子：轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)。 終止子：轉(zhuǎn)錄終止控制區(qū)。,轉(zhuǎn)錄單位,啟動子,終止子,編碼區(qū) （開放閱讀框）,DNA,不對稱轉(zhuǎn)錄的概念：,對于一個基因而言，處在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段, 一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄 對于不同基因而言，模板鏈并非全部在同一條DNA單鏈上,5 3,3 5,模板鏈,編碼鏈,編碼鏈,模板鏈,轉(zhuǎn)錄方向,轉(zhuǎn)錄方向,DNA,RNA聚合酶：催化DNA轉(zhuǎn)錄合成RNA的酶。又稱DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，或DNA依賴的RNA聚合酶。,RNA合成的化學(xué)機制與DNA依賴的DNA聚合酶催化DNA合成（復(fù)制）相似。,( NMP )n +

3、 NTP ( NMP ) n+1 + PPi,RNA,延長的RNA,二、RNA聚合酶（RNA pol）,1.原核生物RNA聚合酶,DNA聚合酶在啟動DNA鏈延長時需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動RNA鏈的延長。 RNA聚合酶和DNA的特殊序列啟動子(promoter)結(jié)合后，就能啟動RNA合成。,原核生物RNA聚合酶由5個亞基組成：a2bbs，是RNA聚合酶的全酶。其中a2bb又稱為RNA聚合酶的核心酶。s為啟動因子。,利福平抑制亞基：是抑制結(jié)合桿菌的特效藥,2.真核生物的RNA聚合酶,依據(jù)對鵝膏蕈堿的敏感性，真核細胞的RNA聚合酶分為三類：,三、啟動子,（一）原核生物啟動子

4、,1. 啟動子:RNA聚合酶與DNA模板結(jié)合的序列。,研究方法：RNA聚合酶保護法（足跡法）,開始轉(zhuǎn)錄,T T G A C A A A C T G T,-35 區(qū),(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 區(qū),RNA-pol辨認位點 (Sextama box，recognition site),用RNA聚合酶保護法研究轉(zhuǎn)錄起始區(qū),A為轉(zhuǎn)錄起始點，而90%以上的基因轉(zhuǎn)錄起始點為嘌呤（A/G）。,（1） Pribnow box （又稱-10序列）：,A為轉(zhuǎn)錄起始點，而90%以上的基因轉(zhuǎn)錄起始點為嘌呤（A/G）。,保守序列為：TTGACA，該序列

5、被s因子所識別，是RNA聚合酶識別位點，即為RNA聚合酶最早結(jié)合的位點。此位點序列很大程度決定啟動子強度，RNA聚合酶易識別強的啟動子。,（2） Sextama box （又稱-35序列）：,RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合,過短或過長的間隔區(qū)序列都會影響RNA聚合酶與啟動子序列的穩(wěn)定性而最終影響到轉(zhuǎn)錄活性。,RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合:,2.真核生物啟動子,催化不同種類的RNA合成。 RNA聚合酶II的啟動子序列多樣。RNA聚合酶II完成了hnRNA的合成作用。,真核生物 RNA聚合酶的啟動子有三種： I、II、III。對應(yīng)各自的RNA聚合酶。,RNA聚合酶II啟動子,轉(zhuǎn)錄起始點區(qū)的通用序

6、列為PyPyCAPyPyPy，其中A為轉(zhuǎn)錄起始點（+1），Py為嘧啶堿基。即在轉(zhuǎn)錄起始點A的兩側(cè)有多個嘧啶核苷酸。 真核RNA聚合酶II起始點序列特征與原核生物E.coli轉(zhuǎn)錄起始點的規(guī)律一致。,（1）帽子位點（cap site）,又稱基本啟動子，在-30-25區(qū)域，通用序列為TATA(A/T)A(A/T)。RNA聚合酶II與TATA框結(jié)合后才能啟動轉(zhuǎn)錄過程。類似原核Pribnow box。 啟動子若缺乏TATA框，轉(zhuǎn)錄會在許多位點開始。,（2）TATA框（TATA box）,保守序列為GG(C/T)CAATCT，一般位于-75附近。該序列可能與控制轉(zhuǎn)錄起始的效率有關(guān)。,（3） CAAT框（C

7、AAT box）,增強子是指能使和它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列，一般在-100以上的區(qū)域。有效的增強子可以位于基因的5端，也可位于基因的3端，有的還可位于基因的內(nèi)含子中。大多為重復(fù)序列。,（4）增強子（enhancer）,第二節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄,1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始,1） s因子與核心酶結(jié)合為RNA聚合酶的全酶 2）s因子找到起始位點，RNA聚合酶與-35序列結(jié)合，即為“DNA-RNA聚合酶”的閉鏈式二元復(fù)合物 3）RNA聚合酶向-10序列滑動，并牢固結(jié)合-10序列，在-10序列與起始點處發(fā)生局部解鏈，形成開鏈式二元復(fù)合物。,5）在b亞基催化下形成RNA的第一個磷酸二酯鍵，形成了“

8、DNA-RNA-RNA聚合酶”的三元復(fù)合物 6）三元復(fù)合物形成并生成6-9個核苷酸后，亞基脫落，核心酶與DNA親和力下降，有利于核心酶在DNA鏈上的滑動. 亞基如果不脫落，轉(zhuǎn)錄無法進入延長階段，并有可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄流產(chǎn)。,三元復(fù)合物,轉(zhuǎn)錄的起始,RNA聚合酶全酶+啟動子DNA處于雙鏈狀態(tài),聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開,RNA聚合酶、DNA和新生RNA,RNA聚合酶核心酶離開啟動子，沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。,共價地向生長RNA鏈的3端添加核糖核苷酸 RNA聚合酶是以5 3 方向來延長RNA鏈 RNA聚合酶本身沿著模板鏈以3 5方向移動 RNA鏈

9、的延長并非恒定速度進行，有延宕現(xiàn)象。,2.轉(zhuǎn)錄的延長,轉(zhuǎn)錄空泡：即為延長階段的“DNA-RNA-RNA聚合酶”三元復(fù)合體,DNA/DNA雙鏈比DNA/RNA雜化雙鏈穩(wěn)定 G-CA-TA-U,轉(zhuǎn)錄延長：,5,3,DNA,原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象,核糖體,RNA,RNA聚合酶,在同一DNA模板上，有多個轉(zhuǎn)錄同時在進行； 轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進行。,這種形狀說明：,電鏡下轉(zhuǎn)錄過程的羽毛狀結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板移動，直至遇到終止信號，停頓下來不再前進，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。,3. 轉(zhuǎn)錄的終止,轉(zhuǎn)錄終止信號存在于RNA聚合酶已轉(zhuǎn)錄過的序列中。,終止子：提供終止

10、信號的序列。,在轉(zhuǎn)錄終止點之前有一段回文結(jié)構(gòu)，回文序列的兩個重復(fù)部分（7-22bp）由一小段不重復(fù)區(qū)隔開，從而形成一個莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。 原核生物兩種轉(zhuǎn)錄終止模式： 不依賴蛋白輔助因子（r因子）的終止模式 依賴蛋白輔助因子（r因子）的終止模式,終止子結(jié)構(gòu)特征：,終止子結(jié)構(gòu)特征,不依賴r因子的終止子 莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中G-C含量豐富，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)之后有一個poly(U)區(qū)。,依賴r因子終止子 莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中G-C含量低，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)之后沒有特定特征。,（1）r因子附著在新生RNA鏈，通過消耗ATP沿新生鏈53方向前行，至與RNA聚合酶結(jié)合 （2）當出現(xiàn)依賴r因子的轉(zhuǎn)錄終止信號時，r因子結(jié)合此特征結(jié)構(gòu)，促使了“DN

11、A-RNA-RNA聚合酶”三元復(fù)合物解聚，釋放出新生RNA鏈，完成了轉(zhuǎn)錄過程,1）依賴r因子的終止,因子的作用原理：,polyC,因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質(zhì)，亞基分子量46kD。 因子能結(jié)合RNA，又以對poly C的結(jié)合力最強。 因子還有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。,轉(zhuǎn)錄終止不需要r因子的參加，當出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止信號時(內(nèi)在終止子 ) ，轉(zhuǎn)錄終止信號自身就可以使“DNA-RNA-RNA聚合酶”三元復(fù)合體解聚，釋放出RNA新生鏈，完成轉(zhuǎn)錄過程。,2）不依賴r因子的終止作用,不依賴r因子的轉(zhuǎn)錄終止,莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機理：,使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物

12、趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。,RNA合成過程,起始階段,雙鏈DNA局部解開,磷酸二酯鍵形成,終止階段,解鏈區(qū)到達基因終點,延長階段,RNA,啟動子（promoter),終止子(terminator),真核生物轉(zhuǎn)錄遠復(fù)雜過原核生物，其轉(zhuǎn)錄激活需要大量各種各樣的轉(zhuǎn)錄因子參加 目前對真核生物轉(zhuǎn)錄終止機制信號、轉(zhuǎn)錄終止機制了解不多 在hnRNA轉(zhuǎn)錄后期的新生鏈會出現(xiàn)“AAUAAA”這個特征序列，被認為是RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄終止信號,第三節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄,一 、轉(zhuǎn)錄起始,轉(zhuǎn)錄因子,能直接、間接辨認和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting facto

13、rs)。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptional factors, TF)。,參與RNA-pol轉(zhuǎn)錄的TF,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化轉(zhuǎn)錄的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA復(fù)合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC組裝完成，TFH使CTD磷酸化,二、轉(zhuǎn)錄延長,真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。 RNA-pol前移處處都遇上核小體。 轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小體,轉(zhuǎn)

14、錄延長中的核小體移位,轉(zhuǎn)錄方向,三、轉(zhuǎn)錄終止,真核生物的轉(zhuǎn)錄終止，是和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的。 真核生物mRNA有聚腺苷酸(poly A)尾巴結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后才加進去的。 轉(zhuǎn)錄不是在poly A的位置上終止，而是超出數(shù)百個乃至上千個核苷酸后才停頓。已發(fā)現(xiàn)，在讀碼框架的下游，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當多的GT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點。,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,轉(zhuǎn)錄終止的修飾點,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān),DNA讀碼框架下游的一組

15、AATAAA和GT共同序列, 參與轉(zhuǎn)錄終止過程。,真核生物的轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾,第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄后加工,由RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，往往需要經(jīng)過一系列的結(jié)構(gòu)改造或修飾，這個過程稱為RNA的成熟，或稱為轉(zhuǎn)錄后加工。,1. RNA鏈的裂解 2.5 端與3端的切除 3.剪接 4.特殊結(jié)構(gòu)的形成 5.堿基修飾和糖苷鍵的改變,轉(zhuǎn)錄后加工包括：,3. 修飾 (modification) 如：G m7G 4. 添加 (addition) 如添加帽子結(jié)構(gòu)、尾巴結(jié)構(gòu)、氨基酸臂等 5. 編輯 (editing),轉(zhuǎn)錄后加工的主要方式,原核生物的mRNA通常沒有轉(zhuǎn)錄后加工過程。 原核生物rRNA 和tRNA必須經(jīng)

16、歷剪切和修飾加工過程,剪切,剪接,一、tRNA和rRNA的加工,即在tRNA3末端添加-CCA氨基酸臂。,添加,修飾作用 甲基化：GmG 還原：U DHU 脫氨: A I 轉(zhuǎn)位: U,原核 rRNA 前體加工過程,甲基化,rRNA的甲基化 即真核45s rRNA在進行剪切之前首先進行了甲基化反應(yīng)。,1. 5-端加帽,二、真核生物mRNA的加工,5 pppGp,帽子結(jié)構(gòu)的生成過程：,加帽,2. 3-端加尾（多聚腺苷酸化）,mRNA 尾部修飾是和轉(zhuǎn)錄終止同時進行的過程。在大多數(shù)真核mRNA3末端添加多聚腺苷酸尾巴（poly A），長度大約在250個左右。 尾巴結(jié)構(gòu)的功能不詳，一般認為尾巴結(jié)構(gòu)提高的

17、mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性即半衰期。,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,轉(zhuǎn)錄終止的修飾點,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄后加工密切相關(guān),DNA讀碼框架下游的一組AATAAA和GT共同序列, 參與轉(zhuǎn)錄終止過程。,3. 剪接作用,剛生成的hnRNA沒有活性，除了需要添加帽子和尾巴結(jié)構(gòu)外，還需要經(jīng)過剪接作用切除內(nèi)含子，連接外顯子，才能轉(zhuǎn)化為有轉(zhuǎn)錄活性的mRNA。,mRNA,真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。,斷裂基因(splite gene),編碼區(qū) A、B、C、D,內(nèi)含子和外顯子,外顯子：在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列。 內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。,內(nèi)含子的“功能”及其在生物進化中的地位是一個引人注目的問題。,雞卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修飾,hnRNA剪接,成熟的mRNA,雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾,生物體內(nèi)的各種內(nèi)含子,剪接過程：,剪接體識別結(jié)合hnRNA的內(nèi)含子5及3區(qū)域 形成套索RNA