細胞轉(zhuǎn)染操作方法及各方法比較

1、細胞轉(zhuǎn)染操作方法 轉(zhuǎn)染 ，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰毎姆独?；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準備程序復(fù)雜，常常對細胞類

2、型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點。需要指出的一點，無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，要獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)，到轉(zhuǎn)染方法的操作細節(jié)，都需要考慮。一、細胞傳代1. 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。3. 用Tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫

3、落下來為止。4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。5. 用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。7. 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。8. 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。二、細胞轉(zhuǎn)染1. 轉(zhuǎn)染試劑的準備 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。 震蕩后將試劑放在20攝氏度保存，使用前還需震蕩。2. 選擇合適的混合比例(1：11：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加

4、入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。3. 將混合液在室溫放置1015分鐘。4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5. 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。6. 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2448小時。三、第二次細胞傳代1. 在轉(zhuǎn)染后24小時，觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。2. 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。轉(zhuǎn)染方法

5、原理主要應(yīng)用特點DEAE葡聚糖法帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細胞內(nèi)吞 瞬時轉(zhuǎn)染相對簡便、重復(fù)比磷酸鈣好，但對細胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時需除血清且一般只用于BSC-1，CV-1，COS細胞系磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，染瞬轉(zhuǎn)染不適用于原代細胞（所需的DNA濃度較高），操作簡便但重復(fù)性差，有些細胞不適用細胞建議用CSCL梯度離心，轉(zhuǎn)染是拷貝數(shù)較多陽離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細胞膜上的唾液酸殘基的負電核結(jié)合；另一種解釋是通過細胞是內(nèi)吞作用而被進入細胞。(若DNA濃度過高，中

6、和脂質(zhì)體表面電核，而降低了與細胞的結(jié)合能力)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染，所有細胞 使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應(yīng)用陽離子聚合物帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進入細胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染，所有細胞 除了具有陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低等特點，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。病毒介導(dǎo)法逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞，之后反轉(zhuǎn)入酶啟動合成DNA并隨機整合到宿主