發(fā)酵工程原理與技術(shù)第二章.ppt

1、第二章 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備原理和技術(shù),第一節(jié) 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的選育,微生物的特性及工業(yè)微生物的要求 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育 發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的退化、復(fù)壯與保藏,有些微生物能在厭氧的條件下生長,有些微生物能夠利用簡單的有機(jī)物和無機(jī)物滿足自身 的生長,有些微生物能進(jìn)行復(fù)雜的代謝,有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物,有些微生物能在極端的環(huán)境下生長,微生物的特性及工業(yè)微生物的要求,微生物的特性,利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物,有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的 可操作性要強(qiáng),遺傳性能要相對穩(wěn)定不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素,產(chǎn)生菌及其產(chǎn)

2、物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病 菌無關(guān)）,工業(yè)化菌種的要求,微生物的特性及工業(yè)微生物的要求,培養(yǎng)條件易于控制,生長迅速，發(fā)酵周期短,發(fā)酵過程產(chǎn)生的泡沫少,不易感染它種微生物或噬菌體,對需要添加的前體物質(zhì)有耐受力，并不能將前體物質(zhì)作為一般的碳源用。,工業(yè)化菌種的要求,微生物的特性及工業(yè)微生物的要求,工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物,細(xì)菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等。 酵母菌（yeast）：屬單細(xì)胞真核生物，主要分布于含糖較多的酸性環(huán)境中。常用的有：啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等。,工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物,霉菌（mould）：喜偏酸性環(huán)境?？捎糜谏a(chǎn)多種酶制劑、

3、抗生素、有機(jī)酸及甾體激素等。 放線菌（actionmycetes）：原核微生物類群。在含有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中分布較為廣泛。主要用于生產(chǎn)多種抗生素,工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物,擔(dān)子菌（basidiomycetes）：主要用于多糖、橡膠物質(zhì)和抗癌藥物的開發(fā)。 藻類（alga）：許多國家已把它作為人類保健食品和飼料。還可通過藻類將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)槭?；國外還有從“藻類農(nóng)場”獲得氫能的報道。,發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的分離和選育,微生物菌種的分離 微生物菌種的選育,微生物菌種的分離,施加選擇性壓力分離法 隨機(jī)分離方法,施加選擇壓力的分離方法,富集培養(yǎng) 供給特殊培養(yǎng)基或加入某些抑制劑。 培養(yǎng)方法 分批式富集培養(yǎng),連

4、續(xù)富集培養(yǎng) 固體培養(yǎng)基,分批式富集培養(yǎng)（搖瓶培養(yǎng)） 重復(fù)移植幾次后，接種已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基，可將優(yōu)勢微生物分離出來。 移種時間是關(guān)鍵，應(yīng)在所需菌占優(yōu)勢時移種。,施加選擇壓力的分離方法,連續(xù)富集培養(yǎng)： 用于連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的菌種選育特別適合。 改變限制性基質(zhì)濃度可以控制兩種菌的比生長速率。,連續(xù)富集培養(yǎng)法可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物，例如用甲烷作碳源篩選到甲烷營養(yǎng)型和一些非甲烷營養(yǎng)型的共生菌。,施加選擇壓力的分離方法,固體培養(yǎng)基的使用 常用于分離酶產(chǎn)生菌，選擇培養(yǎng)基中常含有所需的基質(zhì)，以便促使酶產(chǎn)生菌的生長。 舉例：產(chǎn)堿性蛋白酶的菌的分離。堿性土壤鋪在pH910的瓊脂培養(yǎng)基(含有均勻的不

5、溶性蛋白質(zhì))表面。根據(jù)蛋白質(zhì)水解圈的大小判斷蛋白酶的產(chǎn)生能力。,施加選擇壓力的分離方法,有些微生物的產(chǎn)物對篩選沒有任何選擇性優(yōu)勢。因此常需隨機(jī)地分離。,隨機(jī)分離方法,篩選！,生長因子產(chǎn)生菌的篩選 核苷酸等生長因子的生產(chǎn)不能作為分離步驟中的選擇壓力，可用隨機(jī)辦法分離產(chǎn)生菌，并通過篩選試驗檢出產(chǎn)生菌。 例如：通過觀察分離株能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型的生長，便可檢出生長因子產(chǎn)生菌。,隨機(jī)分離方法-篩選,抗生素產(chǎn)生菌篩選 在含有敏感菌的平板上鑒定抗生作用。也可在液體培養(yǎng)基中，檢測抗菌活性。,隨機(jī)分離方法-篩選,藥理活性化合物的篩選 酶靶法： 基本原理：一種化合物如在體外具有抑制代謝過程的某一關(guān)鍵酶的作用，它在

6、體內(nèi)一般也具有相應(yīng)的藥理作用。 若將體外篩選出的活性化合物，再用動物做實驗，可篩選出新的藥理活性化合物。,隨機(jī)分離方法-篩選,隨機(jī)分離方法-篩選,多糖產(chǎn)生菌的篩選 制糖工業(yè)污水中可能含有很多這種菌種。 可從菌落的黏液狀外觀識別這類產(chǎn)生菌。,隨機(jī)分離方法-篩選,生物進(jìn)化過程中野生型微生物形成完善的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制,不會有代謝產(chǎn)物的積累,解除或突破微生物的代謝調(diào)節(jié)控制,目的產(chǎn)物積累,微生物育種的目的,方法：突變、體內(nèi)重組 體外重組（基因工程）,微生物菌種的選育,經(jīng)典育種：自然選育和誘變育種 定向育種：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等。,微生物菌種的選育,自然選育：利用菌種自然突變(

7、Spontaneous Mutation)進(jìn)行菌種篩選的過程。 自然突變：微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的突變。 引起自然突變兩個原因：多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。,自然選育,前 進(jìn),多因素低劑量誘變效應(yīng)：自然突變實質(zhì)上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)，如宇宙空間各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)以及微生物自身代謝活動中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)(如H2O2)的作用等。,自然突變,互變異構(gòu)效應(yīng)：五種堿基第六位上的酮基和氨基， G 和T可以酮式或烯醇式出現(xiàn)， A 和C可以氨基或亞氨基形式出現(xiàn)。,自然突變,腺嘌呤(adenine, A),鳥嘌呤(guanine,

8、 G),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鳥嘌呤(guanine, G),嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),五種堿基都能形成酮式-烯醇式或氨基-亞氨基的互變異構(gòu)。這兩種異構(gòu)體的平衡關(guān)系受介質(zhì)酸堿環(huán)境的影響。,互變異構(gòu)效應(yīng),互變異構(gòu)效應(yīng),平衡傾向于酮式和氨基時，DNA雙鏈中以AT和GC堿基對為主。 T以烯醇式出現(xiàn)，在DNA復(fù)制到達(dá)該點的一瞬間，與G配對； C以亞氨基出現(xiàn)時，在新合成的DN

9、A單鏈的C點出現(xiàn)A 堿基對發(fā)生自然突變幾率約10-810-9。,結(jié)果： 1、菌種衰退和生產(chǎn)質(zhì)量下降； 2、對生產(chǎn)有益的突變。 為此，菌株應(yīng)定期純化，保存優(yōu)良菌種(復(fù)壯)。 實際生產(chǎn)中，從高產(chǎn)批號中取樣分離單菌落，從中選 出穩(wěn)定菌株用于生產(chǎn)。,自然突變,自然選育,自然選育的優(yōu)越性:簡單易行,可以達(dá)到純化菌種,防止菌種衰退,穩(wěn)定生產(chǎn),提高產(chǎn)量的目的. 缺點:效率低,進(jìn)展慢,很難使生產(chǎn)水平大幅度提高.,自然選育程序： 把菌種制備成單孢子懸液，適當(dāng)稀釋，在平板上分離，挑取單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測定，經(jīng)反復(fù)篩選，以確定生產(chǎn)能力更高的菌株。,自然選育,誘變育種理論基礎(chǔ)：基因突變。,誘變育種,自然突變：自然條件

10、下出現(xiàn)的基因突變。 誘發(fā)突變：用各種物理和生物因素、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。 誘變劑處理使菌種發(fā)生突變頻率和變異幅度提高獲得特性優(yōu)良變異菌株的幾率高。,誘變育種主要步驟,出發(fā)菌株的誘變處理 和 突變體的篩選。,前進(jìn),出發(fā)菌株誘變處理,包括： 出發(fā)菌株的選擇 誘變劑的選擇 誘變劑量和處理時間的確定,返 回,（1）出發(fā)菌株 出發(fā)菌株應(yīng)產(chǎn)量高、對誘變劑敏感性大、變異幅度廣。,幾個應(yīng)注意的問題,（2）復(fù)合誘變因素的使用 野生型菌株用單一誘變因素有時能取得好效果；老菌種單一誘變因素重復(fù)使用突變效果不高，可利用復(fù)合因素、擴(kuò)大誘變幅度，提高誘變效果。 青霉菌選育：先以氮芥處理很短時間而不引起突變，再用U

11、V處理，可使誘變頻率大為提高。提高突變頻率可獲得高產(chǎn)菌株。,幾個應(yīng)注意的問題,乙烯亞胺和UV復(fù)合處理，氯化鋰和UV復(fù)合處理，都用得較普遍，且有一定成效。 氯化鋰本身無誘變作用，與一些誘變因子一起使用時能促進(jìn)突變。,幾個應(yīng)注意的問題,（3）劑量選擇,變異率取決于誘變劑量，變異率和致死率之間有一定關(guān)系。用致死率作為選擇適宜劑量的依據(jù)。 合適劑量：同時增加變異幅度與正突變。,幾個應(yīng)注意的問題,絕大部分個體死亡 少數(shù)存活 多數(shù)未變 少數(shù)突變 多數(shù)負(fù)變 少數(shù)正變 多數(shù)幅度小 少數(shù)幅度大 多數(shù)不宜投產(chǎn) 少數(shù)適宜投產(chǎn) 存活率 突變率 正變率 高產(chǎn)率 投產(chǎn)率,（4）變異菌株的篩選 誘變目的：高產(chǎn)菌株、新產(chǎn)物。

12、,幾個應(yīng)注意的問題,突變體的篩選,一般經(jīng)初篩和復(fù)篩 初篩：一般定性，更多的是通過平板采用變色圈、透明圈、 抑制圈、生長圈或沉淀圈等方法測定某變異特性的 存在，粗略推算出產(chǎn)量，有時也用液體培養(yǎng)。 復(fù)篩：對初篩結(jié)果的菌株生產(chǎn)性能作比較精確的定量測定 還需通過小型和中型發(fā)酵投產(chǎn)試驗才能用于生產(chǎn),例子,前進(jìn),1,2,3,1,1,2,3,初篩,對照(HC0 =HC1+ HC2 + HC3),( HC1 HC0能力增強(qiáng)) ( HC2 HC0能力減弱) ( HC3= HC0能力不變),誘變,1,1,2,3,3,對照(HC0 =HC1+ HC2 + HC3),( HC1 HC0能力增強(qiáng)) ( HC2 HC0能

13、力減弱) ( HC3= HC0能力不變),誘變,1,2,3,3,誘變后的突變株會繼續(xù)變異，低單位菌株在傳代過程中往往占優(yōu)勢，因此復(fù)篩中常常出現(xiàn)產(chǎn)量高低不穩(wěn)的狀態(tài)，必須進(jìn)行自然分離誘變育種和雜交育種必須環(huán)節(jié)。 自然選育和誘變育種交替使用可獲高產(chǎn)菌株。,飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈,指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液,固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。,利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物 能力，工具菌就能圍繞該菌生長,待篩選的菌

14、株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長的物質(zhì),營養(yǎng)缺陷型突變株,抗阻遏和抗反饋突變型,特殊變異菌的篩選方法,組成型突變株,抗（敏感）性突變株,高絲氨酸缺陷菌生產(chǎn)賴氨酸,必需氨基酸 食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)需要量很大 但在代謝過程中，一方面賴氨酸對天冬氨酸激酶有反饋抑制，另一方面還同時生成蘇氨酸和甲硫氨酸，使賴氨酸不能在細(xì)胞內(nèi)累積 高絲氨酸缺陷菌（不能合成高絲氨酸脫氫酶，補(bǔ)充適量高絲氨酸）則合成大量賴氨酸,天冬氨酸,天冬氨酸 磷酸,天冬氨酸 半醛,高絲氨酸,蘇氨酸,甲硫 氨酸,賴氨酸,AK,HSDH,C.glutamicum的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn),AK：天冬氨酸激酶 HSDH：高絲氨酸脫氫酶,營養(yǎng)缺陷型的篩

15、選,淘汰野生型 檢出缺陷型 鑒定缺陷型,前 進(jìn),淘汰野生型,原因： 營養(yǎng)缺陷型的比率很低，只有百分 之幾到千分之幾，淘汰為數(shù)眾多的 野生型菌株，可達(dá)到“濃縮” 營養(yǎng)缺 陷型的目的 方法：抗生素法或菌絲過濾法,返 回,抗生素法,原理：抗生素只殺死生長中的細(xì)菌或真菌，在基本培養(yǎng)基上加抗生素，將野生型細(xì)菌殺死，營養(yǎng)缺陷型不死，從而來濃縮營養(yǎng)缺陷型,細(xì)菌 通常 青霉素 （抑制細(xì)胞壁的合成） 真菌 制霉菌素 （破壞真菌細(xì)胞膜）,返 回,菌絲過濾法,原理：在基本培養(yǎng)基上野生型發(fā)育成菌絲而營養(yǎng)缺陷 型不能，培養(yǎng)一段時間后，用擦鏡紙等合適濾 紙過濾，重復(fù)多次過濾除去大部分野生型個體。,條件：絲狀真菌和放線菌,

16、返 回,檢出缺陷型,A夾層培養(yǎng)法 B逐個檢出法 C影印培養(yǎng)法,返 回,夾層培養(yǎng)法,方法：先倒一薄層不含菌MM，冷凝后加上一層混有經(jīng)過誘變處理的菌液的MM，再澆一薄層不含菌MM，“三明治”，培養(yǎng)長出菌即野生型，在皿底做上記號，再倒第四層CM培養(yǎng)，野生型繼續(xù)繁殖，菌落變大，營養(yǎng)缺陷型開始生長，菌落較小,培養(yǎng)皿側(cè)面,培養(yǎng)皿正面（新、小菌落即營養(yǎng)缺陷型）,返 回,逐個檢出法,依次挑取菌落依次接種在MM和CM培養(yǎng)比較，在完全培養(yǎng)基的某一部位長出菌落而MM不長，則是營養(yǎng)缺陷型,CM MM,CM,營養(yǎng)缺陷型,返 回,影印培養(yǎng)法,完全培養(yǎng)基,影印接種,基本培養(yǎng)基,返 回,影印培養(yǎng)法,返 回,鑒定缺陷型,生長譜

17、法,返 回,生長譜法,方法： 營養(yǎng)缺陷型菌株與MM以一定的濃度混合倒在培養(yǎng)皿上，干燥后，在皿底畫上若干區(qū)域，然后，在正面加上微量的氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等營養(yǎng)物的粉末或結(jié)晶（濾紙片法也可）。 培養(yǎng)后，如果某一營養(yǎng)物的周圍有微生物的生長圈，說明它就是微生物的營養(yǎng)缺陷型。,返 回,誘變,檢出營養(yǎng)缺陷型,淘汰野生型,鑒定營養(yǎng)缺陷型,富集培養(yǎng) （抗生素法） （菌絲過濾法）,夾層培養(yǎng)法 逐個檢出法 影印平板法,生長譜法,營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法,反饋抑制和反饋阻遏,阻遏蛋白,操縱基因,抗反饋抑制和抗反饋阻遏突變株,結(jié)構(gòu)基因突變，使結(jié)構(gòu)酶無結(jié)合能力但有催化活性；末端產(chǎn)物的積累 調(diào)節(jié)基因或操縱基因突變

18、 產(chǎn)生的阻遏蛋白與終產(chǎn)物不能結(jié)合或結(jié)合，但不發(fā)生作用；末端產(chǎn)物的積累,抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變株篩選,方法： 末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物篩選； 未突變者死， 突變?yōu)榭拐呱a(chǎn)菌落 營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株篩選。 活性復(fù)，結(jié)構(gòu)改變,組成酶和誘導(dǎo)酶,組成酶 微生物有些酶總是適量地存在,它們是不依賴 于酶底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶,如葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸過程中的各種酶。 誘導(dǎo)酶 適應(yīng)性酶,是依賴于某種底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。,大腸桿菌乳糖操縱子,i基因,P,O,Lac Z,Lac Y,lac A,有乳糖時,調(diào)節(jié)蛋白亞基,調(diào)節(jié)蛋白 阻遏蛋白,RNA聚合酶,i基因,P,O,Lac Z,L

19、ac Y,lac A,誘導(dǎo)物乳糖,無活性的,阻遏蛋白,轉(zhuǎn)錄,翻譯,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷通透酶,-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶,mRNA,沒有乳糖時,誘導(dǎo)酶弊端,誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。誘導(dǎo)物有時又比較昂貴。 能迅速利用的碳源（如葡萄糖）會引起酶合成的減少.,生產(chǎn)成本提高,組成型突變株,突變發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或操縱基因,解除對誘導(dǎo)物的依賴,可獲組成型突變株。 少數(shù)情況下，組成型突變株可產(chǎn)生大量的、比親本高的多的酶，這種突變株稱為超產(chǎn)突變株。,前 進(jìn),i基因,P,O,Lac Z,Lac Y,lac A,有乳糖時,調(diào)節(jié)蛋白亞基,調(diào)節(jié)蛋白 阻遏蛋白,RNA聚合酶,i

20、基因,P,O,Lac Z,Lac Y,lac A,誘導(dǎo)物乳糖,無活性的,阻遏蛋白,轉(zhuǎn)錄,翻譯,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷通透酶,-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶,mRNA,沒有乳糖時,篩選方法：設(shè)計條件使組成型優(yōu)勢生長，或通過菌落分辨。 加誘導(dǎo)酶合成抑制物 交替培養(yǎng)法 顯色反應(yīng)法,組成型突變株篩選,組成型突變株篩選,加誘導(dǎo)酶合成抑制物 如：加鄰硝基-D-巖藻糖苷，抑制-半乳糖苷酶合成。 誘導(dǎo)型不能利用乳糖，不長；組成型產(chǎn)酶，能利用乳糖，生長，被富集。,組成型突變株篩選,交替培養(yǎng)法 含誘導(dǎo)物（乳糖）中培養(yǎng)組成型快不含誘導(dǎo)物（葡萄糖）中培養(yǎng)誘導(dǎo)型失酶反復(fù)。,組成型突變株篩選,顯色反應(yīng)法 不含誘導(dǎo)物平板培養(yǎng)加底物

21、分解（有顏色變化）檢出。 如:鄰-硝基苯酚半乳糖苷(ONPG)可被-半乳糖苷酶水解為半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚（ONP）,抗（敏感）性突變株篩選,包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體 抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量； 抗噬菌體突變：消除噬菌體污染； 條件抗性突變：如溫度，可提高產(chǎn)量； （溫度敏感突變，高溫呈營養(yǎng)缺陷表型）,抗（敏感）性突變株篩選,敏感突變： 如：檸檬酸-異檸檬酸 氟乙酸抑制順烏頭酸酶 氟乙酸敏感突變型 順烏頭酸酶活性極低，更敏感，異檸檬酸產(chǎn)量 少，檸檬酸積累。,順烏頭酸酶,抗性突變菌株的篩選,抗生素抗性突變株,在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過篩選抗生素抗性突變可提高抗生素產(chǎn)量。,抗生素抗性突變株除能提高抗生素的產(chǎn)量外，還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。,條件抗性突變,因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為野生型菌株的特性