4酶工程制藥.ppt

1、Enzyme Engineering酶工程制藥,第一章 緒論,第一節(jié) 生物催化 第二節(jié) 酶工程的研究?jī)?nèi)容 第三節(jié) 國內(nèi)外酶制劑工業(yè)概況,第一節(jié) 生物催化,新興、前沿學(xué)科往往在學(xué)科交叉中產(chǎn)生,生物技術(shù),醫(yī)藥生物技術(shù) 農(nóng)業(yè)生物技術(shù) 工業(yè)生物技術(shù) 環(huán)境生物技術(shù) 材料生物技術(shù) . . .,用生物或生物分子機(jī)器生產(chǎn)產(chǎn)品和解決問題,生物技術(shù)的具體應(yīng)用,生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的三個(gè)浪潮,醫(yī)藥生物技術(shù): 1982年重組人胰島素上市 農(nóng)業(yè)生物技術(shù): 1996年轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油 菜相繼上市 工業(yè)生物技術(shù): 世紀(jì)之交聚交酯、生物鋼、聚 乳酸相繼上市,工業(yè)生物技術(shù)-邁向發(fā)達(dá)國家之戰(zhàn)略,工業(yè)生物技術(shù),含意：在工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)

2、過程中使用或部分使用生物技術(shù)來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的制造，這種技術(shù)是應(yīng)用微生物和生物催化劑來提供產(chǎn)品和服務(wù)。 核心目標(biāo)：大規(guī)模利用生物體系（如細(xì)胞或酶）作為催化劑實(shí)現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)化。,工業(yè)生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要組成部分,工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展空間,提升傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè) 生物能源 環(huán)境生物技術(shù) 生物材料,底物,生物反應(yīng)器,檢測(cè)控 制儀表,培養(yǎng)基,（滅菌）,經(jīng)加工 原料,酶,細(xì)胞,生物催化劑 （游離或固定化）,機(jī)械能,除 菌,空氣,產(chǎn)品提取純化,副產(chǎn)品 產(chǎn)品 廢物,熱能,原材料,營養(yǎng)物,典型工業(yè)生物技術(shù)過程,核心技術(shù)？,生物催化（Biocatalysis),利用酶或有機(jī)體（細(xì)胞或細(xì)胞器等）作 為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程。,生物

3、催化,化學(xué)工業(yè),發(fā)酵工業(yè),輕工業(yè),采礦,醫(yī)藥,食品,能源,材料,生物安全,環(huán)境,生物催化是工業(yè)生物技術(shù)的核心技術(shù),以生物催化法合成的主要產(chǎn)品,生物催化劑工程的目標(biāo),開發(fā)生物催化劑：催化性能更好、更快，成本更低，催化反應(yīng)更廣泛，功能更多樣 改善性能: 穩(wěn)定性, 活性，溶劑兼容性 開發(fā)分子模型: 新酶的快速重新設(shè)計(jì) 創(chuàng)造新技術(shù): 用于新生物催化劑的開發(fā),生物催化劑工程技術(shù)瓶頸,對(duì)生物催化劑作用機(jī)理缺乏深入的認(rèn)識(shí) 對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物代謝途徑（包括途徑間相互關(guān)系）缺乏理解 細(xì)胞工程化的方法十分有限（即代謝工程） 生產(chǎn)酶和輔因子的成本過高,第二節(jié) 研究?jī)?nèi)容,一概念： 二酶學(xué)研究簡(jiǎn)史 三研究?jī)?nèi)容,一 概念：,

4、酶工程（ Enzyme Engineering） 從應(yīng)用目的出發(fā)研究酶，在一定的生物反應(yīng)裝置中利用酶的催化性質(zhì)，將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用的物質(zhì)，是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合形成的一門新的技術(shù)科學(xué)，是酶學(xué)、微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的邊緣科學(xué)。,二. 酶學(xué)研究簡(jiǎn)史,1878 德國的Kuhne 定義Enzyme 原意為在酵母中 1926 美國的Sumner從刀豆中得到脲酶結(jié)晶（1947年諾貝爾獎(jiǎng)） 1970 美國的Smith 發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶（1979年諾貝爾獎(jiǎng)） 1969 日本固定化氨基?；福谝淮螌⒐潭ɑ赋晒Φ貞?yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)酶工程誕生 1986 美國 核酶發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng),三 研

5、究?jī)?nèi)容,（一）化學(xué)酶工程 （二）生物酶工程,（一）化學(xué)酶工程,1 自然酶的開發(fā) 2 酶的化學(xué)修飾 3 酶的固定化 4 人工合成酶的研究,（二）生物酶工程,1 酶基因的克隆表達(dá) 2 酶的遺傳修飾 3 酶的遺傳設(shè)計(jì),第三節(jié)：國內(nèi)外酶制劑工業(yè)概況,一 國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀 二 國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異 三 我國酶制劑工業(yè)的若干對(duì)策建議,一. 國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀,1、世界三大酶制劑公司 Novo Nordisk （丹麥） Genencor International(美國） Cultor(芬蘭） 三大公司銷售額占世界總額的70%,國際市場(chǎng)酶制劑銷售額比例 2001年工業(yè)酶制劑的世界市場(chǎng)約

6、為15億美元 用于制藥工業(yè)與精細(xì)化學(xué)工業(yè)約1.2億1.5億美元,二 . 我國酶工業(yè)發(fā)展階段,1、1965 無錫酶制劑廠 淀粉酶 2、1979 糖化酶 3、堿性蛋白酶 4、中性蛋白酶 5、1993 耐高溫淀粉酶 6、1998 國外大公司紛紛入駐1999年投產(chǎn),國內(nèi)酶制劑銷售額比例,三. 國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用差異,1規(guī)模： 國外多公司重組 國內(nèi)重復(fù)建設(shè)、效益低 2. 投入： 國外：開發(fā)經(jīng)費(fèi)高達(dá)15%，甚至19%銷售額 國內(nèi)：研究、開發(fā)投入不足，占1%銷售額 3. 開發(fā)重點(diǎn)： 國外：大力研制、開發(fā)新酶種和新用途 國內(nèi)：品種少、劑型少,三我國酶制劑工業(yè)的若干對(duì)策建議,1走集約化、規(guī)?；?jīng)營 2 加大科

7、研投入 3 發(fā)展具有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新技術(shù) 4 . 調(diào)整產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、大力開發(fā)新品種,第二章,微生物發(fā)酵產(chǎn)酶,酶的生產(chǎn)方法,提取分離法,生物合成法,化學(xué)合成法,提取分離法,植物,動(dòng)物,微生物,主要來源,利用微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)：,1、微生物種類繁多，酶的品種齊全。 2、微生物生長(zhǎng)繁殖快，生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高。 3、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，原料來源豐富，價(jià)格低廉， 經(jīng)濟(jì)效益高，并可以通過控制培養(yǎng)條件來提 高酶的產(chǎn)量。 4、微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)力和應(yīng)變能力，可以 通過各種遺傳變異的手段，培育出新的高產(chǎn) 菌株。,1、酶生物合成過程,2、常見產(chǎn)酶微生物,3、酶的發(fā)酵工藝條件及控制,4、酶生產(chǎn)過程的動(dòng)力學(xué),Go,Go,

8、Go,Go,酶生物合成過程,1、中心法則- Central Dogma,2、RNA的生物合成- Transcription,3、蛋白質(zhì)的生物合成- Translation,4、酶生物合成的調(diào)節(jié)- Regulation,Go,Go,Go,Go,1、中心法則-Central Dogma,復(fù)制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。 轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對(duì)原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補(bǔ)的RNA的過程。 翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的AA順序的過程。 逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作

9、用下，生成DNA的過程。,2、RNA的生物合成(轉(zhuǎn)錄)- Transcription,細(xì)胞內(nèi)RNA的生物功能：,(1) 在某些RNA病毒中，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體,(2) 在蛋白質(zhì)的生物合成過程中，各種RNA起著重要的作用。其中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識(shí)別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，由其分子上的三聯(lián)體密碼控制蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質(zhì)一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。,(3) 某些RNA具有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關(guān)的生化反應(yīng)。,(4) 各種小分子RNA在分子修飾

10、和代謝調(diào)節(jié)等方面有 重要作用。,轉(zhuǎn)錄過程,起始位點(diǎn)的識(shí)別 轉(zhuǎn)錄起始 鏈的延伸 轉(zhuǎn)錄終止 轉(zhuǎn)錄后加工,3、蛋白質(zhì)的合成(翻譯)-Translation,翻譯：以RNA中mRNA為模板，按照其 核苷酸順序所組成的密碼指導(dǎo)蛋 白質(zhì)的合成的過程。,mRNA,蛋白質(zhì),翻譯,各種信息 各種蛋白質(zhì),（核苷酸排列順序） （氨基酸排列順序）,蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-mRNA，模板,mRNA是帶有DNA遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的直接模板。 以mRNA為模板,合成一定結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過程(翻譯)，就是將mRNA分子中的核苷酸排列順序轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)分子中的氨基酸排列順序。,蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-遺傳密碼,mRNA分子中,每三

11、個(gè)相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息，稱為密碼子或三聯(lián)密碼。 四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成43個(gè)即64個(gè)密碼子。其中： 一個(gè)起始密碼: AUG 三個(gè)終止密碼: UAA UGA UAG 多數(shù)氨基酸擁有 2-4個(gè)密碼,蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素- 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA ，tRNA,tRNA是氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。 tRNA有特異性，至少有20種以上。每種tRNA的反密碼環(huán)頂端均有由三個(gè)核苷酸組成的反密碼，能與mRNA上相應(yīng)的密碼互補(bǔ)結(jié)合。,酪,5,5,3,AUG,GUU UAC ACA,酪氨酰- tRNA,反密碼,mRNA,密碼與反密碼的堿基配對(duì),蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-核糖體,

12、核糖體（或稱核糖核蛋白體）由蛋白質(zhì)和 rRNA組成。是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微小顆 粒。,蛋白質(zhì)合成的幾個(gè)要素-其他因子和酶,其他輔助因子 工具酶,蛋白質(zhì)的合成過程,肽鏈合成的起始 肽鏈合成的延伸 肽鏈合成的終止與釋放 合成多肽的輸送和加工 蛋白質(zhì)分子的折疊,4、酶生物合成的調(diào)節(jié),基因水平的表達(dá)控制 酶含量的調(diào)節(jié) 操縱子：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位。,常見產(chǎn)酶微生物,基本要求： 不是致病菌 發(fā)酵周期短，產(chǎn)酶量高 不易變異退化 最好是產(chǎn)生胞外酶的菌種，利于分離 對(duì)醫(yī)藥和食品用酶,還應(yīng)考慮安全性： 凡從可食部分或食品加工中傳統(tǒng)使用的微生物生產(chǎn)的酶, 安全! 由非致病微生物

13、制取的酶,需作短期毒性實(shí)驗(yàn)。 非常見微生物制取的酶,需做廣泛的毒性實(shí)驗(yàn),包括慢性 中毒實(shí)驗(yàn)。,(1) 大腸桿菌：是最為著名的原核生物。,形態(tài)：短桿或長(zhǎng)桿狀，0.51.01.03.0 um，革蘭氏陰 性，運(yùn)動(dòng)(周毛)或不運(yùn)動(dòng)，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴(kuò)展，光滑，閃光。 大多數(shù)大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會(huì)引起腹瀉和尿路感染。 大腸桿菌的名聲主要因它易于在實(shí)驗(yàn)室操作、生長(zhǎng)迅速，而且營養(yǎng)要求低。 應(yīng)用： 大腸桿菌能作為宿主供大量的細(xì)菌病毒生長(zhǎng)繁殖 大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等,(2) 醋酸桿菌,

14、菌體從橢圓至桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)（周毛）或不運(yùn)動(dòng)，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。 應(yīng)用：有機(jī)酸(食醋等）葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿 )山梨糖 (維C中間體）,(3)枯草芽孢桿菌,直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。 枯草芽孢桿菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。,(4) 根霉,分類學(xué)上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。 根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營養(yǎng)）。 分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水

15、果、蔬菜的腐爛。 應(yīng)用：根霉能產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)這些酶類的菌種。,(5)曲霉,分類：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門。 分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。 應(yīng)用：是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。,酶的發(fā)酵工藝條件與控制,1、培養(yǎng)基,2、發(fā)酵條件及控制,3、提高產(chǎn)酶的措施,Go,Go,Go,1、選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì) 2、營養(yǎng)物的濃度及配比合適 3、物理、化學(xué)條件適宜 4、經(jīng)濟(jì)節(jié)約 5、精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較,培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件； 培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同；

16、不同階段，培養(yǎng)條件也有所差異。,培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原則,2、發(fā)酵條件及控制,培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。為了維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵時(shí)補(bǔ)加酸、堿。,pH值的控制,有些細(xì)胞可以同時(shí)產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。,通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10，生長(zhǎng)速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來說，溫度直接影響其生長(zhǎng)和合成酶。,溫度的控制,枯草桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為3437,黑曲霉的最適生長(zhǎng)溫度為2832 ,溶解氧的控制,在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中， 處于不同生長(zhǎng)階段的