專業(yè)英語翻譯

1、. 先進(jìn)的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的代謝顯型專業(yè)：藥物分析 學(xué)號：201413176 姓名：張旭關(guān)鍵詞： 全球代謝輪廓 親和色譜 液相色譜 質(zhì)譜 代謝顯型 代謝物組學(xué) 代謝組學(xué) 反相液相色譜 超高液相流動(dòng)相 色譜法 超高液相色譜 摘要：我們回顧目前的分離技術(shù)應(yīng)用于全球代謝輪廓和基于使用液相質(zhì)譜聯(lián)用。目前，大多數(shù)分離使用反相液相色譜法，不能很好的使用反相模式分離的極性化合物，親和色譜是一個(gè)流行的選擇。當(dāng)超高液相色譜法快速、高效的樣品分析的優(yōu)點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)后，逐漸代替了傳統(tǒng)的高效液相色譜法在代謝方面的應(yīng)用。我們討論基于小型化的高效液相分離技術(shù)的選擇性和新興的樣本輪廓方法，或者運(yùn)用超臨界高效液相和高效液相色譜分離

2、。前言：1、代謝產(chǎn)物使用生物標(biāo)記來診斷和理解疾病、疾病機(jī)制，評價(jià)藥物安全性和生理學(xué)（理解潛在生物化學(xué)）的基礎(chǔ)研究不是最新的。為了發(fā)展代謝顯型和利用高通量分析化學(xué)發(fā)展全球代謝產(chǎn)物輪廓，絕大部分目前在利用這些代謝產(chǎn)物先進(jìn)的方法就是利用廣泛輪廓方法學(xué)。此種類型的組學(xué)輪廓，通過它們支持者各方面了解作為代謝組學(xué)或者代謝物組學(xué)。代謝型的大多數(shù)目的是提供代謝產(chǎn)物相關(guān)濃度改變的信息，結(jié)果產(chǎn)生一種確定的生物化學(xué)狀態(tài)以致于檢測特殊條件下專屬性的生物標(biāo)記物（單獨(dú)代謝物更經(jīng)常為指紋）。理論上，這些標(biāo)記物也應(yīng)該提供新的視野在細(xì)胞上器官和整體生物體的生物學(xué)影響、生理學(xué)改變、疾病狀態(tài)和治療或毒性診斷。代謝顯型的進(jìn)程，在第一

3、個(gè)例子中基于假說和目標(biāo)（理想的公平）測定方法。這些方法經(jīng)常提供僅是相關(guān)測定并且目的在于盡可能檢測和測定樣本中的多種成分。目前，全球代謝輪廓使用高通量分析天平實(shí)現(xiàn)，例如核磁共振氫譜和質(zhì)譜。后者可以被用于此輪廓通過直接注入樣品或提取液或者結(jié)合使用色譜或電泳分離。（例如，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，超臨界流體質(zhì)譜聯(lián)用或者毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用）。作為全球代謝輪廓已經(jīng)成熟并且成為系統(tǒng)生物學(xué)和生物標(biāo)記的主流技術(shù)，一種新的挑戰(zhàn)已經(jīng)出現(xiàn)。然而發(fā)表對于流行病學(xué)和臨床代謝顯型綜合的代謝物組學(xué)分析，就是這些技術(shù)包括的一直追求的可負(fù)擔(dān)的、快速、高通量和高容量的方法。在這里，我們借助液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究目前代謝顯

4、型的狀況強(qiáng)調(diào)發(fā)展液相色譜分離。2、 分離還是不分離？ 在基于質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，一個(gè)減少全部復(fù)雜的分析系統(tǒng)的顯而易見的方式就是排除分離步驟。質(zhì)譜的能力就是基于質(zhì)荷比分離粒子已經(jīng)導(dǎo)致許多研究者推斷這樣的結(jié)果可能達(dá)到快速使用直接介紹的方法（直接注入），并且這種基于質(zhì)荷比分離微粒是足夠的，尤其是當(dāng)使用高效質(zhì)譜。并且，確實(shí)對于直接注入法有一種情況涉及速度和實(shí)現(xiàn)的容易程度（對于一些有趣的應(yīng)用見例子10-12）。然而，在不知道樣本無目標(biāo)的分析情況下，這種問題有關(guān)于離子抑制和增強(qiáng)效應(yīng)，并且很難區(qū)別在區(qū)域同分異構(gòu)體和立體異構(gòu)體和同素異形體等，限制了這種方法的價(jià)值。這種分離的優(yōu)點(diǎn)對比更加廣泛無靶標(biāo)的代謝顯型的直接

5、注入質(zhì)譜的例子如圖一，借助納米光設(shè)備，比較大鼠血漿直接注入獲得的光譜數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來源于通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用色譜圖顯示總結(jié)所有的數(shù)據(jù)。相同的四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分光儀在正離子電噴霧模式下應(yīng)用于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。從圖一所列舉的數(shù)據(jù)，有一些借助液相-質(zhì)譜分析的重要的更多的離子檢測比納米噴霧注射是更清晰的。通過檢測馬尿酸鹽和質(zhì)荷比為297.1的峰在液相分析中兩個(gè)大部分強(qiáng)度離子選擇性檢測的直接注入法是很突出顯著的方法。 然而液相-質(zhì)譜聯(lián)用提供了一個(gè)更加廣泛的輪廓，提高了生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)的潛能，一旦生物標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，它是清晰地可以使用直接注入法掃描。首先使用大氣壓固相分析探針（第一次描述被Mc.Ewan等人）借助超高

6、液相質(zhì)譜聯(lián)用定性，通過分析大鼠和狗膽汁來闡明這種方法。隨著和是樣品的準(zhǔn)備，為了分解目前在膽汁中的微團(tuán)，這種簡單方法可以快速檢測許多膽酸和辨別從大鼠和狗中得到的膽汁。已經(jīng)有相關(guān)的例子，一個(gè)具體疾病輪廓，然后像這樣一種方法，隨著廣泛輪廓首次實(shí)行為了確定顯型和簡單直接注入方法，對于隨后的靶向分析可以提供一種途徑來支持高通量掃描在臨床試驗(yàn)的一個(gè)例子。 逐漸增長的可利用的離子手性分離聯(lián)合質(zhì)譜可能改善代謝輪廓，借助包括一種十分快速分離步驟的直接注入方法提供，但仍然不可能去掉直接注入方法的所有的限制。見例子6，在大鼠血漿的初步的結(jié)果依舊表明這種方法在液相分離中的應(yīng)用的優(yōu)越性。然而，對于許多靶向方法，合適有效

7、的直接注入方法有明顯的優(yōu)勢。3、結(jié)合方法 HPLC和它的變形技術(shù)代表目前主要分析技術(shù)用于代謝輪廓。 液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法可能是快速的并且聯(lián)合分離質(zhì)譜提供極佳的，即使底物對于各種不同底物種類和物理化學(xué)特性是依賴的和靈敏的。液相-質(zhì)譜聯(lián)用可以使用的樣品例如尿液、血清或血漿，經(jīng)常是極小的樣品準(zhǔn)備或者依靠原始提取物或化學(xué)修正的形式根據(jù)氣相-質(zhì)譜分析的例子。自從20世紀(jì)末期，基于HPLC分析的應(yīng)用結(jié)合電噴霧質(zhì)譜已經(jīng)形成了絕大多數(shù)文章應(yīng)用于基于液相的代謝組學(xué)或代謝物組學(xué)，當(dāng)超高效液相被引進(jìn)這個(gè)領(lǐng)域在2005年之后，就開始逐漸被替代。 液相-質(zhì)譜應(yīng)用已經(jīng)用于反相色譜分離，隨著親和色譜和離子對色譜變得更加流行，

8、由于反相液相色譜監(jiān)測極性片斷代謝物組學(xué)的局限性已經(jīng)是顯而易見了的。然而，當(dāng)分析一個(gè)復(fù)雜的混合物，一個(gè)寬范圍的極性分析物，沒有一個(gè)理想的解決方法，因此，研究者被迫選擇最好的方案使最大程度上包含樣品中所有組分適于所使用的檢測器。出于這個(gè)原因，絕大多數(shù)代謝顯型實(shí)驗(yàn)已經(jīng)使用反相液相色譜或者與親和色譜或離子對色譜聯(lián)合使用，描述如以下3.3部分中。 3、1 UPLC-MS 同時(shí)在早期的研究中使用LC-MS來分析代謝組學(xué)和代謝物組學(xué)應(yīng)用傳統(tǒng)的HPLC（確實(shí)許多人依舊使用它），一步的改變基于挖掘LC-MS方法的代謝型潛力，發(fā)生在引進(jìn)2m以下粒徑的UPLC/UHPLC的方法。這種先進(jìn)的兼容性的技術(shù)與傳統(tǒng)的HPL

9、C對比如圖2大鼠尿液中成分，借助HPLC和 UPLC分離。正如它顯示的特點(diǎn)，UPLC是更加先進(jìn)的代謝輪廓，結(jié)合隨之而來提高的分辨率（每個(gè)峰分離的更準(zhǔn)確），更高的靈敏度和效率，減少了離子抑制。這些特性已經(jīng)使調(diào)查者能夠顯著的檢測到在一樣的樣品中具有相同分析時(shí)間更多分析物的一個(gè)傳統(tǒng)的HPLC的分離。 應(yīng)用這種類型輪廓關(guān)于生物學(xué)問題一個(gè)早期例子就是使用UPLC-MS的方法描述尿液輪廓來源于三個(gè)家族的Zucker鼠表明家族的差異和一個(gè)重要的年齡軌跡如圖三。 UPLC應(yīng)用于代謝顯型目前代表性“黃金標(biāo)準(zhǔn)”對于這種類型的分析物和此方法已經(jīng)變得普通在代謝輪廓共同體的范圍內(nèi)對于研究人類疾病在癌癥調(diào)查、肥胖、酶誘發(fā)

10、的易變性、肝和腎疾病中。Scopus的調(diào)查揭示在2009年，UHPLC或者UPLC術(shù)語變得同等的與HPLC術(shù)語，2013年，它被頻繁的使用四次在文章中解決代謝組學(xué)和代謝物組學(xué)（此調(diào)查實(shí)行在2014年2月使以上術(shù)語在摘要、關(guān)鍵字和標(biāo)題）。 利用UPLC對于代謝顯型增長的可接受程度反映在最近公開的建議的標(biāo)準(zhǔn)方法（因此叫草案），描述了使用反相-超高效液相質(zhì)譜分析樣品，例如尿液、血清或血漿和組織。 一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是2m以下的粒度的液相色譜是最佳分離發(fā)生在高線速度的流動(dòng)相伴隨著分離行為保持在持續(xù)一個(gè)寬范圍的流速。UPLC寬范圍的最佳流速允許高流速被用于產(chǎn)生非?？焖俜治?，可以從一個(gè)使用2-min反相梯度分

11、離分析大鼠尿液的研究結(jié)果的例子中看出來。分析這種類型產(chǎn)生一種相似水平的顯型的辨別一個(gè)傳統(tǒng)的10minHPLC分離（雖然減少了在大量代謝產(chǎn)物檢測的花費(fèi)比10-min UPLC分析）并且清晰的提供在相同的時(shí)間范圍的直接注入質(zhì)譜的高通量分析的潛能，但也有減少離子抑制的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)效率涉及儀器時(shí)間，這種類型的快速依舊導(dǎo)致大量溶劑消耗，現(xiàn)在已經(jīng)逐漸成為一個(gè)嚴(yán)重的問題由于溶劑的購買和廢液處置的費(fèi)用，作為樣品數(shù)量增加結(jié)合應(yīng)用在流行病學(xué)和臨床研究。溶劑可以被最少的使用借助降低內(nèi)部柱子的直徑，例如1mm，流速范圍為150-250L/min，相同線速度達(dá)到如傳統(tǒng)的內(nèi)徑為2.1mm柱子。這種方法的結(jié)果不僅增加了靈敏度

12、和產(chǎn)率而且減少了溶劑的消耗。一個(gè)全面比較通過應(yīng)用窄范圍UPLC柱子達(dá)到的節(jié)約溶劑的文章最近已經(jīng)發(fā)表并且推測出使用窄?？刂訉?dǎo)致減少4倍在溶劑的花費(fèi)，同時(shí)提供增加了2-3.5倍測定靈敏度。同時(shí)這些透過粒子產(chǎn)生搞得效率，它們需要更高的柱壓比傳統(tǒng)的HPLC達(dá)到600L/min的流速結(jié)合使用2.1mm內(nèi)徑的柱子。一個(gè)可選擇的方法應(yīng)用基于非透過的2m以下的固定相，因此稱為中心殼，柱子可以產(chǎn)生相似的效率，在這么低的壓力下。對于代謝顯型研究這一類方法的例子正出現(xiàn)在文獻(xiàn)中如例子33 應(yīng)用高分辨率的UPLC方法，例如以上的描述，結(jié)果使液相色譜峰寬在此基礎(chǔ)上為要求的1-3s，因此它對質(zhì)譜檢測器產(chǎn)生了一個(gè)重大的挑戰(zhàn)

13、。為了精確的定義色譜峰，它是必要的產(chǎn)生-12個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)通過每個(gè)色譜峰，導(dǎo)致獲得的速率在50ms范圍內(nèi)。然而，對于發(fā)展起來的高分辨率的質(zhì)譜（200,000FWHM）傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜要求數(shù)據(jù)獲得時(shí)間為1s，對于UPLC變得不切實(shí)際，當(dāng)70F線性離子阱、四級桿離子阱和離子阱質(zhì)譜被使用時(shí)，這個(gè)問題才被證實(shí)。與之同時(shí)，在代謝顯型試驗(yàn)中渴望得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí)，儀器責(zé)任周期問題可能導(dǎo)致這個(gè)問題。一種方法被Bateman等人描述來簡化這個(gè)問題，應(yīng)用可選擇的高和低碰撞能快速獲得，高分辨率ToF-MS儀，允許同時(shí)收集初級粒子和產(chǎn)物離子數(shù)據(jù)在一次獲得中，這個(gè)儀器能夠以20-spectra/s獲得數(shù)據(jù)，使它是適

14、合對于高分辨率的液相色譜和已經(jīng)用于許多代謝輪廓的應(yīng)用。 3.2 高溫UPLC 在LC中，最佳分離使用下的參數(shù)就是提高溫度。事實(shí)上，由于缺少所需要溫度的固定相，高溫已經(jīng)不被廣泛使用。同時(shí)采用2m以下粒徑LC導(dǎo)致很大的降低色譜峰寬度35m粒徑用于HPLC，進(jìn)一步改善可以通過高柱溫實(shí)現(xiàn)。因此，高柱溫可以減少流動(dòng)相黏度允許在低壓下操作，并且在分析物洗脫時(shí)可以用來降低有機(jī)改性劑需要的比例（有時(shí)一起被消除）。 HT-LC可以在大量的模式下操作（例如，恒定溫度但可以改變流動(dòng)相組成借助溶劑梯度，或者恒定流動(dòng)相組成結(jié)合一個(gè)溫度梯度），并且，當(dāng)如以上描述，對于代謝組學(xué)分析所有方法使用的例子已經(jīng)被闡述。使用提高UP

15、LC柱溫或者確實(shí)任何包裹柱子的LC分離，產(chǎn)生一個(gè)變化在Van Deemter Plot 中，改變最佳分離位置實(shí)現(xiàn)一個(gè)更高流速，尤其否認(rèn)任何壓力下降的優(yōu)點(diǎn)，但是此方法被描述通過提高流速伴隨著溫度梯度以致于達(dá)到壓力的要求。使用高柱溫增加質(zhì)譜發(fā)射效率，并不是線性增加對于所有分子，通過不能同分析物在柱子中遷移，可能導(dǎo)致靈敏度改變，如果需要的話提供其他方面的最佳選擇條件。對于尿液中代謝輪廓使用HT-UPLC-MS恒定柱溫，第一次在2005年闡明。在這個(gè)例子中，柱溫為90，流速為900L/min和操作壓力為800bar導(dǎo)致峰更大空間分離比700bar溶劑線性梯度的條件下僅在10min。確實(shí)，隨著分析時(shí)間變

16、長(50min)，峰的分離空間容量大于1000也是可能的（如圖4）在另一個(gè)例子，此時(shí)使用溶劑組成恒定（酸化溶液），溫度梯度為50-180，用于家族Zucker 鼠尿液中顯型的研究（二型糖尿病模型），然而，使用HT-UPLC分析血漿的方法是不成功的，并且它是清楚的洗脫非極性代謝產(chǎn)物，例如脂類，依然要求使用包含流動(dòng)相的有機(jī)試劑，雖然可能在較低濃度下比在低溫條件下使用。提高UPLC溫度因此可以提供一些有實(shí)際價(jià)值和經(jīng)濟(jì)利益，但仔細(xì)選擇柱子的學(xué)科知識被要求掌握。當(dāng)并不是所有的柱子都有足夠穩(wěn)定性。根據(jù)以上兩種方法的要點(diǎn)，恒定溫度的模式更易于應(yīng)用，當(dāng)許多U(H)PLC儀器配置一個(gè)恒溫箱。溫差梯度與之同時(shí)可能

17、更加用途廣泛，更加困難的按規(guī)章使用（尤其當(dāng)聯(lián)合恒定壓力通過變化流速來實(shí)現(xiàn)效率最大化）和可能要求調(diào)查研究在一個(gè)更加復(fù)雜的柱溫箱。一個(gè)明顯的擔(dān)憂就是熱不穩(wěn)定化合物和研究者必須清楚的評估對于分解的各個(gè)不穩(wěn)定分析物的潛能在應(yīng)用于HTs時(shí)。3.3 極性代謝物分析LC-MS 正如所討論的，RPLC限制分離極性分析物，并且，為了實(shí)現(xiàn)這樣化合物代謝輪廓，其他操作方法不得不被應(yīng)用。尤其，隨著它原始的應(yīng)用在這個(gè)領(lǐng)域，HILIC使用一個(gè)極性固定相（有許多新的）和一個(gè)更高的有機(jī)流動(dòng)相，例如乙腈（和水改性，作為強(qiáng)的洗脫劑）逐漸被用于極性代謝產(chǎn)物。在這種操作模式下，更加親脂化合物很難吸附在固定相而很快被洗脫。但更多極性化

18、合物易保留并且僅僅被洗脫當(dāng)極性水溶液濃度增加時(shí)，HILIC有一個(gè)突出重要益處超過正相液相色譜，在水相樣品有更大的兼容性在流動(dòng)相中，簡化了樣品的引入。然而，HILIC有更低的在線容量比RPLC，因此僅能使用小體積注射，降低了測定靈敏度（盡管使用更高極性的有機(jī)流動(dòng)相提高離子化作用可以在一定程度上得到補(bǔ)償）。HILIC也能顯著產(chǎn)生更寬色譜峰比RPLC，導(dǎo)致更低峰容量和峰的分辨率更大程度上依賴質(zhì)譜。 盡管這些缺點(diǎn)，HILIC 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)更多用途用于分析代謝顯型樣品，例如，尿液。HILIC已經(jīng)被用于結(jié)合MS/MS發(fā)展多分析檢測被稱為靶向代謝輪廓模式。HILIC-MS、MS使用一個(gè)氨基化合物的UPLC柱子導(dǎo)

19、致定量檢測140極性代謝產(chǎn)物在單一注射酒或水果提取物。比較UPLC型HILIC和RP-UHPLC對于大鼠尿液泌尿輪廓已經(jīng)展示，表明兩種方法都能分離不同顯型，但對于那種方法，不必驚訝，這種檢測依靠不同的生物標(biāo)記物。其他的研究尿液中極性代謝物的色譜法，應(yīng)用HILIC的方法，水相NPLC和RPLC表明對于兩性離子，評價(jià)HILIC柱子能給出更好的結(jié)果，同時(shí)一個(gè)最近研究也評估一定范圍內(nèi)。相的發(fā)現(xiàn)HILIC在DIOL柱子得到最好的效果。另外，應(yīng)用結(jié)合HILIC和RPLC-MS方法已經(jīng)發(fā)展為輪廓更加廣泛的脂類和以碳中心的代謝菌的代謝產(chǎn)物和癌細(xì)胞和人類血漿。在同樣的方法，如T,kindt等。比較HILIC和R

20、PLC對于植物代謝組學(xué)。圖五表明一個(gè)典型HILIC分離尿中的代謝物，分析時(shí)間為20min。色譜圖表明相關(guān)色譜較寬的峰是HILIC的特征。對比于RPLC，但此方法表明良好保留時(shí)間重現(xiàn)性（CV=1.7）和一個(gè)平均CV為14%達(dá)到信號強(qiáng)度超過被200樣品分析。 LC-MS分析法使用HILIC-MS分析尿液樣本源自在大鼠中半乳糖胺的肝毒性的研究，表明了一個(gè)清晰的統(tǒng)計(jì)學(xué)的不同在模型組和給藥組，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度揭示大量尿酸。N-乙酰葡萄胺和tyramin一起極大增加了一定量的2-氧代葡萄糖鹽在大鼠中。 然而，同時(shí)廣泛使用HILIC并不代表對極性化合物是通用的，結(jié)果一定范圍內(nèi)，不得不探索其他選擇。固定相例如

21、石墨化碳，同時(shí)高保留對于極性化合物和提供更有效的分離對于磷酸核糖核苷酸和核糖核酸出現(xiàn)保持一些分析物不可逆（例如丙酮酸鹽、乳糖、果糖、1,6-biphosphate)。 二氧化硅-氯化物固定相已經(jīng)被建議對于極性代謝物，但是，仍然很少它們應(yīng)用的例子。目前，對于極性、陰離子代謝物大部分廣泛應(yīng)用的方法是IPC，一般使用三丁基胺作為IP試劑，同時(shí)大多數(shù)發(fā)表的例子已經(jīng)發(fā)展為靶向分析例如中心碳代謝物，它們對一般的污染損害系統(tǒng)極性陰離子化合物也有很好的表現(xiàn)并且因此同等適用于非靶向分析。結(jié)合這種方法的主要困難就是IP試劑此后阻礙了它是適用于由于離子抑制的正離子電噴霧。改變IP試劑在系統(tǒng)中所有途徑是一個(gè)問題和時(shí)間

22、的消耗(即使成功),事實(shí)上，這可能意味著采用IPC將要求提供一個(gè)完全LC-MS系統(tǒng)對此方法從這以后。同時(shí)離子交換色譜（IELC）代表一個(gè)明顯的選擇性對于已經(jīng)有的IPC，與之相關(guān)很少的對于它的應(yīng)用的例子在全球代謝輪廓。 同時(shí)HILIC、IPC和IELC已經(jīng)表明提供分析極性化合物的方法，補(bǔ)充這些RPLC的方法，都有限制并且它們并沒有代表一個(gè)完全的解決對于極性分析物。直到更早的200s甚至Sio2 RPLC限制PH范圍為3-7。即將到來的混合Sio2構(gòu)型固定相已經(jīng)允許更多的堿性流動(dòng)相，將被探索PH達(dá)到11。對于保留極性堿性組分的高PH流動(dòng)相的優(yōu)點(diǎn)第一次被Neue和Mazzeo描述。主要的優(yōu)點(diǎn)是清晰表

23、明使用一個(gè)高PH流動(dòng)相改變堿性分析物的離子狀態(tài)，例如胺、中性的物質(zhì)允許它們使用RP條件保留和分離。對于代謝顯型高PH 的LC-MS 方法潛在的優(yōu)點(diǎn)。最近被Rainville等人調(diào)查研究，表明對于高極性組分不僅增加保留時(shí)間（使用酸溶劑系統(tǒng)被傳統(tǒng)RPLC無效柱子洗脫),而且可以分離特定的異構(gòu)體，同時(shí)被好的保留在酸性基于溶劑RPLC中仍然未被解決，當(dāng)在一個(gè)更低的一面如圖六。這些軌跡顯示了一個(gè)信號峰，m/z為358.269，使用一個(gè)酸性流動(dòng)相，洗脫的保留時(shí)間為10.68min，當(dāng)色譜分離時(shí)使用一個(gè)堿性流動(dòng)相，兩個(gè)明顯分析物洗脫時(shí)間分別為9.03min和10.72min。同時(shí)也不能代表完全的回答極性代謝

24、物，這樣高PH 溶劑系統(tǒng)在策略上可能證明是有用的對于特定困難的代謝物輪廓的分析4、1未來技術(shù)：使小型化 正在發(fā)展起來一種必須達(dá)到來自更小的樣品高質(zhì)量的代謝輪廓。這樣的改變的先驅(qū)者正在增加它的使用例如遺傳性改變小鼠模型，允許研究者更大程度上模擬人類疾病比目前為止可能增加了詮釋人類疾病發(fā)現(xiàn)的自信。然而，這些小鼠模型可能是非常貴的，花費(fèi)每只動(dòng)物在每只動(dòng)物￥1000-5000范圍內(nèi)。因此，出于科學(xué)、經(jīng)濟(jì)和倫理的原因，研究者義不容辭的達(dá)到最大化信息量，同時(shí)最小化動(dòng)物使用。這樣做就需要僅僅小的血液樣品（2030L）從小動(dòng)物中得到超過一個(gè)或多個(gè)研究課題和發(fā)展并且應(yīng)用微量樣品技術(shù)，或者在玻璃毛細(xì)管中或者在合適

25、底物血液凝固點(diǎn)來促進(jìn)收集這樣小體積血液對于這種類型工作。色譜系統(tǒng)小型化能夠使它對應(yīng)減少樣品型號并不代表是一個(gè)特別的問題，因?yàn)樗且粋€(gè)可升級的過程。最近在微型規(guī)模LC的發(fā)展意味著現(xiàn)在開始看見了它的應(yīng)用在小分子微粒分析中，例如藥物生物分析和代謝物的鑒定用相似與傳統(tǒng)規(guī)模LC的色譜行為。另外，重大的提高在質(zhì)譜反應(yīng)，在一些情況的20倍，已經(jīng)注釋使用這些微量分離方法。應(yīng)用微量(或納米級）LC-MS代謝輪廓包括檢測極性陽離子代謝物在人類腦脊髓液中，和極性陰離子代謝在HeLa細(xì)胞中，小鼠腦提取液、血漿和腦脊髓液。為了改善多電荷組分的峰形，必須添加金屬螯合試劑EDTA在流動(dòng)相中。另外，Kiefer等人已經(jīng)應(yīng)用納

26、米規(guī)模IP-RP-HPLC-MS分析細(xì)胞提取中陰離子成分。一個(gè)例子的結(jié)果可能達(dá)到這種類型方法學(xué)的要求如圖七顯示來自得到在更低一個(gè)病人的膽固醇水平的羅蘇伐他汀藥濃度的血液凝固點(diǎn)的分析。這個(gè)結(jié)果得到借助LC-MS方法分析一個(gè)20L血液樣品的一部分使用一個(gè)150m ID微流量LC裝置結(jié)合一個(gè)QToF的質(zhì)譜在正離子電噴霧模式。從這個(gè)分析中它是可能不僅檢測藥物本身而且描述出提取血液位點(diǎn)脂的輪廓。這個(gè)系統(tǒng)已經(jīng)用于分析大鼠膽汁，展示一個(gè)全部良好的精力和穩(wěn)定的表現(xiàn)在整個(gè)分析的1000份樣品的流程中沒有色譜峰形的變化。（Plum等人沒有發(fā)表這些觀察結(jié)果）。這些原始數(shù)據(jù)暗示微量LC的發(fā)展可能已經(jīng)成熟到一點(diǎn)，可以應(yīng)用它在一般的代謝輪廓實(shí)驗(yàn)室中）。4.2超臨界流體色譜 SFC看到一個(gè)興趣的復(fù)蘇由于這種類型色譜圖展現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，例如更快速的質(zhì)譜轉(zhuǎn)換和更短的分析時(shí)間比同等的RPLC分離，使它成為基于LC手性分離選擇的綱領(lǐng)。這些特征，結(jié)合快速溶