《谷蛋白提取實驗》PPT課件.ppt

1、實驗一 小麥高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）的提取,一、實驗目的,了解小麥HMW-GS提取及SDS-PAGE原理。 掌握小麥HMW-GS提取及SDS-PAGE方法。,小麥HMW-GS變異類型,圖1 以中國春（CS）為基準的各種小麥HMW-GS的SDS-PAGE譜帶及亞基的編號（a、b、c、d等）（Payne lawrence,1983）,二、實驗原理,變性劑SDS破壞蛋白質分子結構。強還原劑巰基乙醇使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，裂解后的氨基酸側鏈和SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS膠束。 蛋白質-SDS膠束在水溶液中的形狀像一個長橢圓棒，橢圓棒的短軸對不同的蛋白質亞基-SDS膠束基

2、本是相同的，但長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。 膠束在SDS-PAGE中的電泳遷移率主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質或亞基分子量的大小。SDS電泳不僅可以分離蛋白質，而且可以根據遷移率的大小測定蛋白質亞基的分子量。,圖1 蛋白質樣品用SDS和還原劑處理后解聚成亞基,不連續(xù)電泳包括兩種不同孔徑的凝膠：濃縮膠和分離膠。 濃縮膠：凝膠濃度較小，孔徑相對較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過較大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶，使樣品組分在分離膠中得以高分辨率的分離。 分離膠：又稱電泳膠，通?？讖捷^小，通過選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好的分離。分離膠又可為均一膠和梯度膠。本實

3、驗用的是均一膠。,二、實驗原理,圖2 SDS不連續(xù)電泳（分離膠為均勻膠）,1. 實驗儀器 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及配套電泳槽、搖床、 臺式離心機、微量移液器、 電子天平 2. 實驗試劑 樣品提取液、1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液、0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液、30% Acr-0.8% Bis溶液 、10% SDS溶液、1.5% 過硫酸銨溶液、 Tris-甘氨酸電極緩沖液、考馬斯亮蘭染色液,三、實驗儀器和實驗試劑,2. 實驗試劑,1 樣品提取母液: 6g SDS(十二烷基硫酸鈉)+37.5ml 0.5M Tris-HCl（pH6.8） +30.0mg溴酚蘭+17.4ml蒸餾

4、水+30ml甘油 2 樣品提取液: 27.2ml樣品提取母液+ 4.8ml -巰基乙醇+64ml蒸餾水 3 1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液:18.17g Tris 溶于40ml水中，加濃HCl調pH至8.8，定容到100ml 4 0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液:6.05g Tris溶于40ml水中，加濃HCl調pH 至6.8，定容到100ml 5 30% Acr(丙烯酰胺)-0.8% Bis(N, N-甲叉雙丙烯酰胺)溶液: 30gAcr+0.8gBis溶于40ml水中，定容到100ml 6 10% SDS溶液:10g SDS加40ml蒸餾水溶解，定容到100ml

5、7 1.5% 過硫酸銨（AP）溶液:0.15g AP溶于10ml蒸餾水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。 8 Tris-甘氨酸電極緩沖液:3.032g Tris+1g SDS+14.4g甘氨酸,定至1000ml 9 考馬斯亮蘭染色液:250ml甲醇+100ml乙酸+0.6g考馬斯亮蘭+250ml蒸餾水 10 脫色液:50ml甲醇+50ml乙酸+400ml蒸餾水；也可以直接用自來水作脫色液,四、實驗步驟,將小麥籽粒砸碎放入1.5ml離心管 加入400ul 50%異丙醇溶液，60水浴30min，其間搖晃2次。10000rpm離心3min，棄上清液 重復以上步驟2次 加入100ul提取液B1（50%異丙醇+0.3%二硫

6、代蘇糖醇），60水浴30min 加入100ul提取液B2（50%異丙醇+1.4%（v/v）4-乙烯基吡啶），60水浴1h，10000rpm離心10min 把160ul上清液轉移到新的離心管中，并在其中加600ul丙酮，放在41.5-2h 10000rpm離心10min，棄上清液，在沉淀中加入100ul樣品提取液，放置2h以上，沉淀充分溶解后即可使用。,五 制膠與電泳,（1）取一套或兩套干凈的制膠專用玻璃板，在制膠架上 固定好 （2）先按照表1的比例制好分離膠，搖勻后灌到玻璃板 間，上端留2.5cm左右空間，加入蒸餾水；等待分離 膠凝結的時間里，按表2的比例制好濃縮膠預工作液 （加入前四項）,表1 分離膠工作液的配制,表2 濃縮膠工作液的配制,五 制膠與電泳,（3）分離膠凝結后膠面與水面之間會出現(xiàn)清晰的界面，此 時將水倒出來，用濾紙把剩余的水吸干；在濃縮膠預 工作液中加入表2中要求的1.5% AP及TEMED，混勻后 灌進玻璃板內，迅速插入樣梳 （4）濃縮膠凝固后將其從制膠架上取下來，拔出樣梳，用 蒸餾水水將點樣孔沖干凈；將膠板夾在電泳槽上，在 電泳槽的倒入電極緩沖液，上樣量為4ul （5）接通電源，每板膠穩(wěn)流12-15mA，指示劑出膠后再跑2 h，停止電泳； （6）揭開玻璃板，切下濃縮膠，將分離膠放到染色液內， 染色15-30分鐘（視染色液