豬病診斷技術(shù)

1、一、豬病綜合診斷,（一）現(xiàn)場快速診斷 1、臨診流行病學(xué)調(diào)查； 2、臨診癥狀觀察； 3、尸體剖檢。 （二）實驗室診斷 1、病理組織學(xué)診斷； 2、病原（因）學(xué)診斷； 3、血清學(xué)診斷。,1、豬病流行病學(xué)調(diào)查的步驟和內(nèi)容,（1）調(diào)查步驟及方式 根據(jù)檢測材料的不同，動物流行病學(xué)調(diào)查分為臨診流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查和病原學(xué)流行病學(xué)調(diào)查?，F(xiàn)就臨診流行病學(xué)調(diào)查的方式、內(nèi)容進(jìn)行討論。方式多樣化,如充分利用公司銷售網(wǎng)絡(luò)、現(xiàn)代通訊手段或以座談方式向畜主或相關(guān)知情人員詢問疫情，或到現(xiàn)場進(jìn)行仔細(xì)調(diào)研，取得第一手資料，然后進(jìn)行綜合歸納、分析處理，作出初步診斷。,（2）調(diào)查內(nèi)容 疾病流行情況：最初發(fā)病時間、地點，隨

2、后蔓延的情況，目前的疫情分布。疫區(qū)內(nèi)豬的飼養(yǎng)數(shù)量和分布情況，發(fā)病豬的數(shù)量、年齡、性別、品種，疫病傳播速度和持續(xù)時間等。本次發(fā)病后是否進(jìn)行過診斷，采取過哪些措施，效果如何。防疫情況如何，接種過哪些疫苗，疫苗來源、免疫方法和劑量、接種次數(shù)等。是否做過免疫監(jiān)測，群體抗體水平如何。發(fā)病前有無飼養(yǎng)管理、飼料、用藥、氣候等變化或其他應(yīng)激因素存在。查明感染率、發(fā)病率、病死率和死亡率。,特別關(guān)注以下指標(biāo)的調(diào)查,感染率：受檢豬中陽性豬數(shù)/受檢豬數(shù)100% 發(fā)病率：某一段時期內(nèi)某一特定風(fēng)險豬群發(fā)生某病比率。調(diào)查時期常為一年；特定豬群可指某個地區(qū)、某個豬場、某個豬群、甚至某個豬場內(nèi)的某個日齡段的豬等。而風(fēng)險豬群專指

3、未患過該病因而缺乏特異抵抗力而有患該病風(fēng)險的豬群。發(fā)病率直接測定發(fā)病風(fēng)險，是分析病因的重要依據(jù)。,患病率：特定時間所調(diào)查豬群中某病新舊病例數(shù)，而不管這些病例的發(fā)病時間,反映了某病的致病力。 病死率：是指在一定的時間內(nèi)，患某病的病豬中因該病而死亡的比值。病死率反映了某種疾病的死亡概率，表示疾病的嚴(yán)重程度，也反映治療水平。多用于急性病，較少用于慢性病。 死亡率：是某豬群在一定時間內(nèi)因某病死亡豬數(shù)與該豬群同期平均數(shù)之比。 反映豬群總的死亡水平，是衡量豬群因病死亡危險（機(jī)會）大小的指標(biāo)。也反映一個地區(qū)不同時期豬群的健康狀況、衛(wèi)生保健水平。,疫情來源情況：本地過去曾否發(fā)生過類似的疫病，在何時何地發(fā)生，流

4、行情況如何，是否經(jīng)過確診，有無歷史資料可查，何時采取過何種防治措施，效果如何；如本地未發(fā)生過，附近地區(qū)曾否發(fā)生過；這次發(fā)病前，周邊地區(qū)有無疫情；曾否由其他地方引進(jìn)過活豬、豬產(chǎn)品或飼料，輸出地有無類似的疫病存在；是否有外來人員進(jìn)入本場或本地區(qū)進(jìn)行參觀、訪問或購銷等活動。,傳播途徑和方式情況：本地各類有關(guān)豬的飼養(yǎng)管理制度和方法；活豬尤其是病豬流動、收購以及防疫衛(wèi)生情況；交通檢疫、市場檢疫和屠宰檢驗的情況；病死豬處理睛況；有哪些助長疫病傳播蔓延的因素和控制疫病的經(jīng)驗；疫區(qū)的地理、地形、河流、交通、氣候、植被和野生動物、節(jié)肢動物等的分布和活動情況，它們與疫病的發(fā)生及蔓延傳播之間有無關(guān)系等。 其他：該地

5、區(qū)的政治、經(jīng)濟(jì)基本情況，群眾生產(chǎn)和生活活動的基本情況和特點，畜牧獸醫(yī)機(jī)構(gòu)和工作的基本情況，當(dāng)?shù)仡I(lǐng)導(dǎo)、獸醫(yī)、飼養(yǎng)員和群眾對疫情的看法如何等。,2、臨診癥狀觀察,就是用望、聞、問、切、叩、嗅等最基本的癥狀觀察方法，通過我們的眼、耳、手、鼻和腦等發(fā)現(xiàn)癥狀，經(jīng)過分析，做出癥狀診斷。 主要包括： （1）病豬登記：登記畜主、地址、通訊、豬的有關(guān)信息； （2）全面系統(tǒng)檢查：外觀病癥、體溫(37.539)、眼結(jié)膜、精神、叫聲、運動、呼吸、消化、泌尿等系統(tǒng)檢查。,3、尸體剖檢（后期專門講解）,尸體剖檢是診斷豬流行性疾病（傳染病、部分非傳染性疾病和寄生蟲病）最客觀、最直接、最簡便、最快速的臨床診斷方法。 我國豬流

6、行性疾病的致病因素非常復(fù)雜，多為混合感染、繼發(fā)感染、多因素疾病，單從病原學(xué)或血清學(xué)的方法診斷疾病，很難做出確切診斷，不易分清主次病因，難免出現(xiàn)主觀武斷或片面錯誤的結(jié)論。從尸體剖檢入手結(jié)合病原學(xué)、血清學(xué)及病理組織學(xué)診斷才能得出科學(xué)的診斷結(jié)論。,4、病理組織學(xué)診斷,病理組織學(xué)診斷：就是取病變組織，通過切片或涂片、染色處理，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞組織病變，對疾病做出診斷。包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)方法。 組織樣品采集及送檢： （1）一般包括肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、心臟、淋巴結(jié)、腦等。 （2）采樣部位：應(yīng)采集病變與正常組織交界處的組織，以便于診斷觀察。 （3）采樣大小：采集的組織樣品不宜過大，一般采集1

7、.51.5cm大小的組織塊，置于10%福爾馬林溶液中，同一動物的組織應(yīng)保存于一個容器中。 （4）樣品的保存及運送：樣品經(jīng)固定后可長期保存，送至實驗室做病理組織學(xué)檢查。,5、病原（因）學(xué)診斷,對致病原因做微生物分離培養(yǎng)、鑒定或利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，查找致病病毒、病原菌、寄生蟲等，屬病原學(xué)診斷。 （1）傳統(tǒng)方法： 病毒：接種細(xì)胞分離病毒；電鏡觀察病毒粒子；光鏡觀察包涵體或進(jìn)行免疫組化檢測病原相關(guān)抗原；動物接種試驗等。 細(xì)菌：直接染色觀察；分離鑒定；動物接種試驗等. 寄生蟲：直接觀察或經(jīng)處理光鏡觀察。 霉菌毒素：色譜儀、紫光儀、免疫學(xué)方法等檢測毒素含量。,（2）現(xiàn)代分子生物學(xué)（基因診斷）方法 基因

8、診斷是采用分子生物學(xué)方法在DNA水平或RNA水平對某一基因進(jìn)行分析，從而對特定的疾病進(jìn)行診斷?；蛟\斷可以利用特定的DNA探針與目的基因形成分子雜交的機(jī)理，也可以利用已知DNA序列設(shè)計引物對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從DNA水平和mRNA的基因轉(zhuǎn)錄水平上檢測出正在生長的病原體或潛伏病原體，確定現(xiàn)行感染還是以往感染；省卻有些病原體原來需體外培養(yǎng)后方可診斷的步驟。從而對傳染性疾病作出診斷。,感染性疾病外源性基因的檢測：主要包括感染性病毒、細(xì)菌、支原體、寄生蟲等在豬體內(nèi)存在的生物外源性DNA或RNA。 這類檢測一般根據(jù)已知的外源DNA序列采用PCR或RT-PCR的方法就可以進(jìn)行快速、簡便而準(zhǔn)確的診斷；

9、因而，傳染性疾病的基因診斷應(yīng)用性極強(qiáng)，目前已經(jīng)在臨床上普遍開展。,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)。通過檢測特定基因進(jìn)而檢測病原體，PCR現(xiàn)已成為基因診斷的主要方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時等特點；而反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)則用于檢測RNA病原體。,分子探針技術(shù)：DNA探針雜交技術(shù)是以已知DNA片段作為探針與待測樣品DNA或其片段進(jìn)行核酸分子雜交，從而確定兩者的同源程度。另外，根據(jù)重組技術(shù)所制造的基因芯片，即將特定序列DNA片段（基因探針）固定在硅片上，用于基因測序，尋找病原的目的基因或?qū)虻男蛄羞M(jìn)行分子水平上的分析 。,主要豬病病原檢驗取樣樣品參考表,6.血清學(xué)診斷,（1）凝

10、集試驗 凝集試驗的原理是：顆?？乖?紅細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等)與含有相應(yīng)抗體的血清混合,在電解質(zhì)的參與下, 則能發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物,這種復(fù)合物呈均勻狀態(tài)懸浮于液體中,這時肉眼是看不見的,當(dāng)抗原抗體復(fù)合物在一定濃度的電解質(zhì)作用下,復(fù)合物表面的電荷大部分被消除,失去了互相排斥的作用，復(fù)合物之間互相吸引，凝集成團(tuán),即出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。作用于凝集反應(yīng)的抗原,稱為凝集原,與之相結(jié)合的抗體,稱為凝集素。,全血平板凝集試驗:本試驗在實踐中主要用于細(xì)菌性疾病的抗體檢測和抗原(經(jīng)分離培養(yǎng)后)的鑒定。如豬丹毒抗原(丹毒桿菌的純培養(yǎng)液)測定被檢豬血清中的抗體。 試管凝集試驗:試管凝集試驗是一種定量

11、法,用于測定被檢血清或其他體液中有否某種抗體及其效價,可作臨床的輔助診斷,或用于流行病學(xué)監(jiān)測。在豬場中,本法常用于豬布氏桿菌病的診斷。,間接紅細(xì)胞凝集試驗：本法簡稱間接血凝試驗。其原理是：將抗原(或抗體)吸附在比其體積大千萬倍的紅細(xì)胞表面,只需少量的抗體(或抗原)就可使這種致敏的紅細(xì)胞通過抗原和抗體的結(jié)合而出現(xiàn)肉眼清晰可見的凝集現(xiàn)象。這種試驗?zāi)艽蟠筇岣叻磻?yīng)的敏感性,如豬瘟檢測. 用抗體致敏紅細(xì)胞檢測相應(yīng)的抗原,稱為反向間接血凝試驗,反之,稱為正向間接血凝試驗。在豬病的診斷中,常采用本法對豬口蹄疫、水皰病、豬瘟、傳染性胸膜肺炎等疾病抗原的鑒定,或抗體的檢測。,乳膠凝集試驗：本法在豬病中主要用于偽

12、狂犬病和萎縮性鼻炎的診斷,是用其病毒致敏乳膠抗原來檢測被檢豬的血清、全血或乳汁中的抗體,具有簡便、快速、特異、 敏感的優(yōu)點。,（2）沉淀試驗 沉淀試驗的原理是：利用可溶性抗原如細(xì)菌的培養(yǎng)濾液、病毒的可溶性抗原和血清等,與相應(yīng)的抗體結(jié)合,在電解質(zhì)存在時,可形成肉眼可見的白色沉淀物。參加沉淀反應(yīng)的抗原,稱為沉淀原，抗體叫做沉淀素。沉淀試驗的具體方法有多種,如環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗和免疫電泳等。在豬病的診斷中,目前最常用的是瓊脂擴(kuò)散試驗。本法可用已知抗原測定未知抗體,反之亦然。在豬病的實驗室診斷中，常用于豬偽狂犬病的抗體檢測,也可用此法檢查豬瘟、豬水皰病和豬痘等疾病。,（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(E

13、LISA)免疫酶技術(shù)是根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的功能,以酶作標(biāo)記物,利用酶對底物具有高效催化作用的原理而設(shè)計的,它既可用于抗原的診斷,也可進(jìn)行血清抗體的檢測。本試驗是通過化學(xué)方法將酶與抗體(或抗原)結(jié)合起來, 標(biāo)記后的抗體(或抗原)仍然保持與相應(yīng)抗原(或抗體)相結(jié)合的免疫學(xué)活性。例如,酶抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后,形成酶標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物。復(fù)合物中的酶在遇到相應(yīng)的底物時,催化底物分解、氧化而生成有色物質(zhì),有色產(chǎn)物的出現(xiàn),客觀地反映了酶的存在。,根據(jù)有色產(chǎn)物的有無及其濃度,即可間接推斷被檢抗原或抗體是否存在及其數(shù)量,達(dá)到定性和定量的目的。 目前對于豬瘟、偽狂犬病、繁殖與呼吸綜合征、流行性腹瀉、旋毛蟲病

14、、豬氣喘病等疾病, 均采用免疫酶技術(shù)進(jìn)行病原診斷，抗體檢測和血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查,并且已成為規(guī)?；i場化驗室工作的一項重要內(nèi)容。,二、診斷檢測樣品的采集、處理和運送,（一）采樣原則 1. 適時采樣：樣品是有時間要求的，應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定時間采樣；有臨床癥狀需要作病原分離的，樣品必須在病初的發(fā)熱期或癥狀典型時采樣，病死的動物，應(yīng)立即采樣。 2 .合理采樣：根據(jù)診斷檢測要求，須嚴(yán)格按照規(guī)定采集各種足夠數(shù)量的樣品外，不同疫病的需檢樣品各異，應(yīng)按可能的疫病側(cè)重采樣。對未能確定為何種疫病的，應(yīng)全面采樣.,3. 典型采樣：選取未經(jīng)藥物治療、癥狀最典型或病變最明顯的樣品，如有并發(fā)癥，還應(yīng)兼顧采樣。 4 .無菌采樣：

15、供病原學(xué)及血清學(xué)檢驗的樣品，必須無菌操作采樣，采樣用具、容器均須滅菌處理，尸體剖檢需采集樣品的，先采樣后檢查，以免人為污染樣品。 5. 適量采樣：采集樣品的數(shù)量要滿足診斷檢測的需要，并留有余地，以備必要的復(fù)檢使用。,6 樣品處理:采集的樣品應(yīng)一種樣品一個容器，立即密封，根據(jù)樣品的形狀及檢驗要求不同，做暫時的冷藏、冷凍或其他處理。供病毒學(xué)檢驗的樣品，數(shù)小時內(nèi)要送到實驗室，可只作冷藏處理。超過數(shù)小時的應(yīng)凍結(jié)處理。（凍結(jié)方法：可將樣品放入-30度冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后再裝入小冰塊或干冰冷藏瓶（箱）內(nèi)運送）。供細(xì)菌學(xué)檢驗或血清學(xué)檢驗的樣品，冷藏送實驗室即可。,裝樣品的容器應(yīng)貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽要防止因凍結(jié)而脫落，

16、標(biāo)簽標(biāo)明采集時間、地點、號碼和樣品名稱并附上發(fā)病、死亡等相關(guān)資料，盡快送實驗室。 7 安全采樣: 采樣過程中，需做好采樣人員的安全防護(hù)，并防止病原污染，尤其必須防止外來疫病的擴(kuò)散，避免事故發(fā)生。,（二）血清 1.采血方法及采血量：從耳靜脈（或前腔靜脈）采血5毫升，室溫放置約10分鐘（以血液完全凝固為準(zhǔn)），再置冰箱冷藏（4度）30分鐘，此時，能清楚看到血清與血凝塊分離，然后分離血清，保存于1.5-2毫升塑料離心管中，冷凍保存待檢。 2 .編號要求：所有送檢樣品統(tǒng)一用阿拉伯?dāng)?shù)字1、2、3、-編號（養(yǎng)殖場請保存好原豬號與送檢編號對照表）。,3. 樣品說明：所有送檢樣品要求附帶采樣場場名、免疫情況（免

17、疫程序、免疫疫苗種類、生產(chǎn)廠、免疫劑量等）、采樣對象等詳細(xì)說明材料。 4.運輸：每個養(yǎng)殖場的樣品必須單獨密封于兩層自封口塑料袋中，粘貼單位名稱標(biāo)簽，外包一層脫脂棉后，連同采樣單一并放入稍大一些的自封口塑料袋，置于冰盒或裝有冰袋的泡沫箱中迅速運至檢測室。如不能及時送檢，應(yīng)將血清凍存于冰箱中。,（三）血液,1 病毒檢驗樣品：應(yīng)在動物發(fā)病初體溫升高期間采集。血液樣品必須是脫纖血或是抗凝血?？鼓齽┛蛇x肝素或EDTA，枸櫞酸鈉對病毒有輕微毒性，一般不宜采用。采血前，在真空采血管或其他容器內(nèi)按每10ml血液加入0.1%肝素 1ml或EDTA20ml,從前腔靜脈真空采血或用注射器抽取，用量少時也可以從耳靜脈

18、抽取。采集的血液立即與抗凝劑充分混合，防止凝固；采脫纖血液時，先在容器內(nèi)加入適量小玻璃珠，加入血液后，反復(fù)振蕩，以便脫去血液纖維。采集的血液經(jīng)密封后貼上標(biāo)簽，以冷藏狀態(tài)立即送實驗室。必要時，可在血液中按每毫升加入青霉素和鏈霉素各500-1000IU，以抑制血源性或采血中污染的細(xì)菌。,2 細(xì)菌檢驗樣品：采血應(yīng)在動物發(fā)病初體溫升高或發(fā)病期，并未經(jīng)藥物治療期間采集，血液應(yīng)脫纖獲加肝素抗凝劑（或EDTA或枸櫞酸鈉），但不可加入抗生素。血液密封后貼上標(biāo)簽，冷藏盡快送實驗室，否則須置于4度冰箱內(nèi)做暫時保存，但時間不宜過久，以免溶血。 3 寄生蟲及附紅細(xì)胞體病檢驗樣品：因不同的血液寄生蟲在血液中出現(xiàn)的時機(jī)及部位各不相同，因此，需要根據(jù)各種血液寄生蟲的特點，取相應(yīng)時機(jī)及部位的血液制成血涂片，送實驗室。,（四）組織,組織樣品一般由撲殺動物或撲殺垂死的動物和病死尸體剖檢中采集，也可以從活動物體內(nèi)采集。從尸體采樣時，先剝?nèi)游镄馗共科つw，以無菌器械將腹腔、胸腔打開，根據(jù)檢驗?zāi)康暮蜕耙卟〉某醪皆\斷，無菌采集不同的組織。從活動物體采取組織樣品，一般需使用特殊的器械。,1 病毒檢驗樣品：做病毒檢驗的組織，必須以無菌技術(shù)采集，組織應(yīng)分別放入無菌的容器內(nèi)并立即密封，貼上標(biāo)簽，放入冷藏容器立即送實驗室。如果途中時間較長，可作凍