感受態(tài)細(xì)胞的制備方法

1、感受態(tài)細(xì)胞的制備方法1、 感受態(tài)定義、作用、常用制備方法及原理2、 感受態(tài)細(xì)胞不好用的原因3、 影響轉(zhuǎn)化效率的原因4、 為何要低溫環(huán)境制備1.感受態(tài)定義：細(xì)胞能夠從周圍環(huán)境中攝取DNA分子，并且不易被細(xì)胞內(nèi)的限制性核酸內(nèi)切酶分解時(shí)所處的一種特殊生理狀態(tài)稱感受態(tài)（competence）。作用：如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。感受態(tài)的目的是增加細(xì)胞的通透性，以便外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的目的。優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞膜通透性增大，方便大分子的進(jìn)入。意義是實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞，完成實(shí)驗(yàn)。常用制備方法：細(xì)菌感受態(tài)少量制備法（CaCl2法）、細(xì)菌感

2、受態(tài)大量制備法、細(xì)菌電轉(zhuǎn)化法等詳見基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)p153-157.2.感受態(tài)細(xì)胞做得不好的原因一菌液OD值偏大或偏小二原始菌株不好三試劑超純程度不夠四操作時(shí)對(duì)菌體傷害過大3.影響轉(zhuǎn)化效率的原因1細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度,盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過檢測(cè)OD600來控制.DH5菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5107/ml）；2所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；3經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加,24小時(shí)達(dá)到最高,之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的）；4化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)

3、上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；5所使用的器皿必須干凈.跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；7一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；4為何要低溫環(huán)境制備在制備過程中,細(xì)胞膜通透性增大而變得脆弱,低溫能提高感受態(tài)細(xì)胞存活率.所以在制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)要保持低溫和不能劇烈震蕩.如果放于-20保存，時(shí)間長(zhǎng)了細(xì)胞內(nèi)部液化度較高的情況下，細(xì)胞會(huì)由于流動(dòng)性的原因造成不可逆損傷，甚至死亡。所以要放于-80攝氏度。原理：利用化學(xué)法C

4、aCl2處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DH5大腸桿菌或TG1大腸桿菌（-為何選擇這兩種菌、兩種菌的不同處、生長(zhǎng)曲線的不同處），使其對(duì)外源DNA通透性增加，從而達(dá)到外源DNA分子進(jìn)入細(xì)菌的目的。BL21一般用于外源基因的原核表達(dá)，DH5a，TG1和HB2151一般用于重組質(zhì)粒的克隆和擴(kuò)增。TG1長(zhǎng)得慢，菌落較小，轉(zhuǎn)化效率高，用于普通的克隆測(cè)序，BL21(DE3)長(zhǎng)的快，菌落較大，轉(zhuǎn)化效率低點(diǎn)，主要用于原核表達(dá)。DH5是擴(kuò)增菌，BL21是表達(dá)菌DH5可以使質(zhì)粒高拷貝數(shù)擴(kuò)增，BL21利于蛋白的表達(dá)，另外表達(dá)菌還有很多，ps系列，roset系列等DH5大腸桿菌：此種大腸桿菌，是一種誘變菌株，主要表現(xiàn)對(duì)外源DNA的免

5、疫缺乏。是用于基因工程的菌種，相比于正常菌種缺少了一定的免疫機(jī)制。試劑：（1） DH5E.coli菌株E.coliK-12衍生菌（2） 80mM（mmol/L）CaCl2（滅菌）（0.44g50mL，搖勻；0.88gCaCl2100mLH2O）（3） 液體LB培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)室直接購買現(xiàn)成的，不需要配制）（-濃度是如何確定的這個(gè)查查看我沒查過看看濃度是否有影響）取250mL三角瓶2，洗凈2.5g100mLddH2O并搖勻使其溶解后，按1:1000比例加入100L1mol/L（1M）NaOH調(diào)節(jié)至PH7.0（4） 甘油（100%甘油，10mL或20mL）15mL/管2高溫滅菌121，20min對(duì)于E

6、.coli菌株用8種不同濃度的CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞,然后轉(zhuǎn)化各濃度的感受態(tài)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度CaCl2溶液處理所得到的感受態(tài)細(xì)胞,其轉(zhuǎn)化效率有很大的不同。隨著CaCl2濃度增高,轉(zhuǎn)化效率也隨之提高,在80mmol/L100mmol/L時(shí)達(dá)到峰值,進(jìn)一步提高CaCl2的濃度,轉(zhuǎn)化效率急劇下降。（CaCl2濃度對(duì)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響王友如(湖北師范學(xué)院生物系,湖北黃石)）滅菌的準(zhǔn)備及試劑配置（1） CaCl2，100mL分裝于2個(gè)50mL管中，滅菌備用。（2） 甘油，10mL備用滅菌（3） 1個(gè)AmpLB固體培養(yǎng)基平板（用于劃線，挑去單克隆菌株）（4） 100mLAmp培養(yǎng)基（5

7、） 1020個(gè)10mL離心管48個(gè)50mL離心管感受態(tài)細(xì)胞的制備（化學(xué)CaCl2法）-實(shí)驗(yàn)操作中嚴(yán)格滅菌、低溫、速度 DH5菌株在AmpLB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37培養(yǎng)1216h，至其長(zhǎng)出單克隆菌株。（-劃線作用、培養(yǎng)時(shí)間作用）TG1菌株生長(zhǎng)速度比DH5快，只需37培養(yǎng)812h劃線作用用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線而達(dá)到純化分離微生物的一種方法。是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離的目的。用于目的微生物的分離，便于得到目的性狀的單克隆。培養(yǎng)時(shí)間從圖1可以看出,重組大腸桿菌DH5生長(zhǎng)的4個(gè)時(shí)期區(qū)分非常明顯。03h為遲緩期,重組大腸桿菌適應(yīng)新的環(huán)境,繁殖的速度很慢

8、;49h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很充分,重組大腸桿菌呈對(duì)數(shù)快速增長(zhǎng);1016h為穩(wěn)定期,由于培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷地被消耗掉,重組大腸桿菌新陳代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的積累以及pH值下降等因素的影響,重組大腸桿菌繁殖的速度逐漸下降,而死亡的細(xì)菌數(shù)開始逐漸增加,增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平衡,細(xì)菌總數(shù)處于穩(wěn)定的狀態(tài);1720h為衰亡期,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少,而毒性物質(zhì)越來越多,重組大腸桿菌的繁殖速度就逐漸減緩,死亡菌數(shù)明顯增多,衰亡的速度超過繁殖的速度,細(xì)菌總數(shù)就呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。所以選擇培養(yǎng)時(shí)間為1216小時(shí)。 AmpLB平板上挑取單菌落，輕移至1mLLBAmp液體培養(yǎng)基中（2mL離心管），37220rpm/

9、min，搖床37培養(yǎng)8h左右。 取1mL2的空白培養(yǎng)基做對(duì)照暫存于4度，將1mL活化菌液全部轉(zhuǎn)移至100mLLBAmp液體培養(yǎng)基中，37，220rpm/min培養(yǎng)2h3h，使其OD600約等于0.40.6（處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）（-培養(yǎng)時(shí)間可否延長(zhǎng)，OD值為何測(cè)OD600，其數(shù)值可否超過0.6，原因什么）注：測(cè)OD值準(zhǔn)備-槍、槍頭、菌液、空白培養(yǎng)基、ddH2O、紙巾空白對(duì)照：第三步去除的空白培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組：搖菌后的菌進(jìn)行第四步之前準(zhǔn)備冰、冰盒、10ml管、菌液全部埋于冰中。2ml或1.5ml空管放-20預(yù)冷。培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該不能延長(zhǎng)，死亡細(xì)菌數(shù)量會(huì)增多，造成細(xì)菌總量下降。OD600實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和

10、生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)液在600nm處的吸光值，得到的OD600的數(shù)值如果在0.6-0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD6003表明細(xì)菌已經(jīng)飽和等。細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,可以通過測(cè)OD600來監(jiān)測(cè)。細(xì)菌的生長(zhǎng)比較好的時(shí)期是在OD600為1時(shí),此時(shí)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)代等研究.在細(xì)菌的培養(yǎng)中,OD600超過0.8就要稀釋培養(yǎng)液。不同的菌種的OD600的標(biāo)準(zhǔn)可能不同，對(duì)于DH5而言，OD600值為0

11、.40.6為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。如果超過0.6的話，細(xì)菌的繁殖速度開始下降、生長(zhǎng)力下降，一些細(xì)菌會(huì)老化死亡。 將培養(yǎng)液置于冰上10min，然后，將菌液分裝至10mL管中，3000rpm或4000rpm4度離心4min6min，收集細(xì)菌沉淀。 棄上清（把剩余菌液吸掉?。┯妙A(yù)冷的80mmol/LCaCl2輕輕重懸細(xì)菌（輕輕吹打，10次左右），每20mL培養(yǎng)液可用2mLCaCl2重懸，然后，置于冰上冰浴4060min，30004000rpm4度離心6min10min，棄上清，保留菌體沉淀。（-CaCl2作用） 每100mL液體培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)56mLCaCl2/甘油重懸每管1mL或2mL都可CaCl2/甘油溶液為

12、=（-為何用CaCl2/甘油溶液=1:4保菌有什么說法） 感受態(tài)細(xì)胞置于-80或-40冰箱保存?zhèn)溆?。?mL離心管或1.5ml離心管(之前已提前預(yù)冷)分裝好，離心管要提前置于-20預(yù)冷。注：TG1菌株（8h）比DH5菌株（16h）生長(zhǎng)速度快近一倍。CaCl2作用：增加細(xì)胞的通透性細(xì)菌處于0,CaCl2的低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理,促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物.鈣離子的作用是結(jié)合于細(xì)胞膜上,是細(xì)胞膜呈現(xiàn)一種液晶態(tài).在冷熱變化刺激下液晶態(tài)的細(xì)胞膜表面會(huì)產(chǎn)生裂隙,使外源DNA進(jìn)入.甘油作用：保菌一、冷凍保存時(shí)菌液會(huì)被凍起來，內(nèi)部產(chǎn)生的“冰晶”會(huì)使細(xì)胞破裂等